放线菌概述

　　放线菌是介于**与丝状**之间而又接近于**的一类丝状原核生物(有人认为它是**中的一类)，因菌落呈放射状而得名。1877年由合兹(Harz)首先发现一种寄生于牛体的厌气性牛型放线菌，从此便引用了Actinomyces这个属名，后来又发现了好气性腐生的种类，也叫放线菌。1984年，美国学者是瓦克斯曼(Waksman)把好气性腐生放线菌另立为链霉菌属，以与放线菌属相区别，而将厌气性寄生的种类仍保留原名--放线菌属(Actinomyces)。我国现在也采用此分类系统。苏联学者在拉西里尼科夫则将二者均归入放线菌属，这种系统只苏联和东欧一些国家采用。

　　放线菌多为腐生，少数寄生，与人类关系十分密切。腐生型在自然界物质循环中起着相当重要的作用，而寄生型可引起人、动物、植物的**。这些**可分为两大类，一类是放线菌病，由一些放线菌所引起，如马铃薯疮痂病、动物皮肤病、肺部感染、脑膜炎等;另一类为诺卡氏菌病，由诺卡氏菌引起的人畜**，如皮肤病、肺部感染、足菌病等。此外，放线菌具有特殊的土霉味，易使水和食品变味。有的能破坏棉毛织品、纸张等，给人类造成经济损失。只要掌握了有关放线菌的知识，充分了解其特性，就可控制、利用和改造它们，使之更好地为人类服务。

　　放线菌*突出的特性之一是能产生大量的、种类繁多的***。人们在寻找、生产***的过程中，逐步积累了有关放线菌的生态、形态、分类、生理特性及其代谢等方面的知识。据估计，全世界共发现4，000多种***，其中绝大多数由放线菌产生。这是其他生物难以比拟的。***是主要的化学疗剂，现在临床所用的***种类占井冈霉素、庆丰霉素、我国用的菌肥"5406"也是由泾阳链霉菌制成;有的放线菌还用于生产维生素、酶制剂;此外，在甾体转化、石油脱蜡、烃类发酵、污水处理等方面也有应用。在理论研究中也有重要意义。因此，近30多年来，放线菌在微生物中特别受到重视。

放线菌的分布

　　放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界。不论数量和种类，以土壤中*多。据测定，每克土壤可含数万乃至数百万个孢子，但受土壤性质、季节、作物种类等条件的影响。一般情况下，肥土较瘦土多，农田土比森林土多，中性或偏碱性土壤中也较多。土壤环境因子如有机质、水分、温度、通气状况等也影响其数量。它适宜在含水量较低的土壤内生长。而厩肥和堆肥中**于高温放线菌活动。放线菌所产生的代谢产物往往使土壤具有特殊的泥腥味。

　　河流和湖泊中，放线菌数量不多，大多为小单孢菌、游动放线菌和孢囊链霉菌，还有少数链霉菌。海洋中的放线菌多半来自土壤或生存在漂浮海面的藻体上。海水中还存在耐盐放线菌。

　　大气中也存在着大量的放线菌菌丝和孢子，它们并非原生的微生物区系，而是由于土壤、动植物、食品甚至衣物等表面均有大量的放线菌存在，由于它们耐干燥，常随尘埃、水滴，借助风力飞入大气所致。

　　食品上常常生长放线菌，尤其在比较干燥、温暖的条件下易于大量繁殖，使食品发出刺鼻的霉味。

　　健康动物，特别是反刍动物的肠道内有着大量的放线菌，它们可有是肠道内定居的微生物，堆肥中的高温放线菌可能来源于此。在动物和植物体表有大量的腐生性放线菌，偶尔也有寄生性放线菌存在。

　　了解放线菌的分布，对于进一步开发放线菌资源， 发现和筛选新的***，无疑是很重要的。

放线菌的鉴定

　　1 通过光学显微镜对分离出的菌落进行观察并且通过放线菌的形态特征来鉴定出放线菌(放线菌的菌落一般为圆形，菌落质地紧密表面绒状且干燥);

　　2 通过显微镜对放线菌的孢子丝和孢子进行观察来鉴定出放线菌(放线菌的孢子 丝在特定时候形成的孢子含有不同色素，成熟的孢子也有特定的颜色);

　　3 用革兰氏染液对放线菌进行复染(放线菌是有分支状菌丝体的**，革兰染色为阳性，染色后放线菌与环境形成对比，能清楚地观察到放线菌的形态特征)。

放线菌检测方法

　　一、 检测用培养基配方与培养条件

　　1. 培养基：高氏1号培养基

　　配方：可溶性淀粉 2g ，KNO3 0.1g ，K2HPO4 0.05g ，MgSO4• 7H2O 0.05g ，NaCl 0.05g ，FeSO4• 7H2O 0.001g (母液) ，琼脂 2g ，自来水 100mL 。

　　先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后**，备用。

　　2. 培养条件： 温度：27℃-30℃;时间：36--48小时。

　　二、检测与计数方法

　　1. 系列稀释

　　称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水(无菌水中事先加入了分散剂1—2滴，分散剂可以是吐温，OP—10，用来分散菌团)，用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后上旋转式摇床200 r/min充分振荡40—60 min，,即成母液菌悬液(基础液)。

　　2. 用1mL无菌移液管分别吸取1.0mL上述母液菌悬液加入9 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:1×k稀释的菌悬液(每个稀释度应更换无菌移液管)。

　　3. 加样及培养

　　取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。

　　4. 菌落识别

　　根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。

　　5. 菌落计数

　　以出现20—150个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。有效菌平均菌落数在20—150之间时，则以该菌落数计算。

　　有效活菌数按式(1)计算，同时计算杂菌数：

　　nm = kv1/(m0v2) ×10-8 或 nv = kv1/(v0v2) ×10-8 (1)

　　式中：

　　nm — 质量有效活菌数， 亿/g

　　nv — 体积有效活菌数， 亿/mL

　　— 有效菌落平均数， 个

　　k — 稀释倍数

　　v1 — 基础液体积， mL

　　v2 — 菌悬液加入量， mL

　　v0 — 样品量， mL

　　m0 — 样品量， g

　　重点需要注意的部分在菌悬液的制备及震荡过程上，因为固态发酵的的产品大部分为聚集状态不容易分散开来，这点与液态发酵产品不同。所以：

　　① 悬液中要加分散剂分散菌团;

　　② 震荡时间也要较液态发酵产品时间长，使用旋转式摇床控制在180——200r/min 。

土壤中放线菌的分离

　　(1)取9套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度(10-3、10-4、10-5)、组别、姓名、操作日期等。每个稀释度做三个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。

　　(2)将土样放入用酒精擦拭过的乳钵中，除去石块、草根、研磨压碎后，称取5g，放入盛有45ml无菌水的三角瓶中。振荡10min，即10-1的土壤悬液，静置30s。

　　(3)另取装有9ml无菌水的试管4支，编号10-2、10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中(每个稀释度换1支无菌吸管)。

　　(4)用无菌吸管从浓度*小稀释液开始，每次吸取0.5ml加到一组相应编号(10-5)的高氏一号平板上(每次吸取前，吸管要在液体内吹吸几次)，再依次将10-4、10-3的土壤稀释液加到相应平板上。用无菌刮棒(从浓度小的稀释液开始)将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。

　　(5)接种完毕，将平皿放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌(主要是链霉菌)菌落。

　　(6)挑4株菌划线接种在高氏一号合成培养基斜面上，28℃培养7天，作拮抗试验用。