青霉素概述

　　青霉素(Benzyl penicillin / Penicillin)又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是**素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏**的细胞壁并在**细胞的繁殖期起**作用的一类***，是**种能够**人类**的***。青霉素类***是β-内酰胺类中一大类***的总称。

　　青霉素在目前的制药工业中占有举足轻重的地位，生产规模非常大。通过数十年的完善，青霉素针剂和口服青霉素已能分别**肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、白喉、炭疽等病，增强了人类**传染性**的能力。研究和优化其生产工艺对人类健康有重要意义

青霉素的生产工艺

　　一、工艺流程

　　1、发酵工艺流程

　　1)丝状菌的青霉素发酵工艺流程：

　　沙土管→斜面母瓶(孢子培养，25℃，6～7d)→大米孢子斜面(孢子培养，25℃，6～7d)→种子罐(种子培养，25℃，40～45h)→繁殖罐(种子培养，25℃，13～15h)→发酵罐(发酵，26℃，6～7d)→放罐

　　2)球状菌的青霉素发酵工艺流程：

　　冷冻管→斜面母瓶(孢子培养，25℃，6～8d)→大米孢子斜面(孢子培养，25℃，8～10d)→种子罐(种子培养，28℃，50～60h)→发酵罐(发酵，26℃，6～7d)→放罐

　　2、工艺控制

　　(1)影响发酵产率的因素

　　基质浓度

　　在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏(或抑制)或对菌丝生长产生抑制(如葡萄糖和钱的阻遏或抑制 , ***的生长抑制), 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 , 为了避免这一现象 , 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 , 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的*适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加 , 因为即使是超出*适浓度范围较小的波动 , 都将引起严重的阻遏或限制 , 使生物合成速度减慢或停止。目前 , 糖浓度的检测尚难在线进 行 , 故葡萄糖的 流加不是依据糖浓度控制 , 而是间接根据pH 值、溶氧或 C02 释放率予以调节。

　　(2)温度

　　青霉素发酵的*适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 °C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至 青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , *适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。

　　(3) pH 值

　　青霉素发酵的*适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流 加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低; 过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起 pH 值上升。

　　(4)溶氧

　　对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长**或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流 加控制的一个参考指标。

　　(5)菌丝浓度

　　发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。

　　(6)菌丝生长速度

　　用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持*大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为 临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。

　　(7)菌丝形态

　　在长期的菌株改良中 , 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触, 故一般比生产速率较高; 后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的传递速率大大提高, 从而允许更多的菌丝生长 (即临界菌体浓度较高),发酵罐体积产率甚至高于前者。

　　在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。

青霉素的精制

　　1、浓缩

　　在***提取和精制的过程中，常需要通过蒸发将发酵滤液或提取液进一步浓缩，以利于后序操作。***生产中有真空浓缩和薄膜蒸发浓缩。

　　2、干燥

　　干燥的目的是除去***中所含的水分，以提高产品的稳定性，有利于产品的加工、储存和使用。常用的干燥方法有减压干燥、喷雾干燥、气流干燥、冷冻干燥等。此外也有使用常压干燥、固定床干燥及红外线干燥等。

　　3、脱色和去热原

　　提炼往往是注射用***提取中不可缺少的一个单元操作。这一步操作的好坏，不仅影响下一道工序，更重要的是关系到成品的色极及热原试验等质量指标。用活性碳可除去各种色素，同时也能出去热原。

　　4、结晶

　　***的精制过程中常常通过结晶的方法来制得较高纯度的成品。***的精制方法很多，生产中常用的结晶方法有以下几种：改变温度结晶、利用等电点结晶、加成盐剂结晶、加入不同溶剂结晶、共沸结晶。另外还有盐析法、中间盐转移法、晶体洗涤法等几种精制方法。重结晶是进一步提纯精制***的有效方法，通过重结晶方法可获得高纯度***产品。

青霉素酶及其活力测定法

　　一、培养基

　　胨　15g

　　甘油　50g

　　氯化钠　4g

　　0.1%硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液　0.5ml

　　枸橼酸钠　5.88g

　　20%硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液　1ml

　　磷酸氢二钾　4g

　　肉浸液　1000ml

　　混合上述成分，调节pH值使**后为7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃**30分钟。

　　二、酶溶液的制备

　　取蜡样芽孢杆菌[Bacillus cereus CMCC(B)63301]的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后，取此培养物接种至其余各瓶培养基内，每瓶接种10ml，同时每瓶加入无菌青霉素4500单位，在25℃摇床培养24小时，再加无菌青霉素2万单位，继续培养24小时，再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体，调pH值至约8.5,用滤柱滤过**，滤液用无菌操作调pH值至近中性后，分装于适宜容器内，在10℃以下贮存，备用。

　　三、酶活力测定法

　　1、青霉素溶液

　　称取青霉素钠(钾)适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。

　　2、青霉素酶稀释液

　　取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0) 稀释成每1ml中约含青霉素酶8000～12 000单位的溶液，在37℃预热。

　　3、测定法

　　精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)[精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度]25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。

　　空白试验

　　取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式计算：

　　E=(B-A)×M×F×D×100

　　式中

　　E为青霉素酶活力，(单位/ml)/小时;

　　B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml;

　　A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml;

　　M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L;

　　F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的单位数;

　　D为青霉素酶溶液的稀释倍数。

青霉素效价的生物测定

　　一、材料和器皿

　　⑴菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。

　　⑵培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(作生物测定用时，平板应分上下两层，上层需另加0.5%葡萄糖)。

　　⑶试剂

　　①1%pH6磷酸缓冲液：K2HPO40.2g(或K2HPO4·3H2O0.253g)，K2HPO40.8g，蒸馏水100ml。

　　②0.85%Nacl生理盐水溶液。

　　③苄青霉素钠盐：1.667U/mg(1U即1国际单位，等于0.6ug)。

　　⑷其他：牛津小杯[不锈钢小管，内径(6+0.1)mm，外径(8+0.1)mm，高(10+0.1)mm]，培养皿(直径90mm，深20mm;大小一致，皿底平坦)，试管、滴管、移液管(5、1ml)及大口10ml移液管等。

　　二、方法和步骤

　　1. 敏感菌悬液的制备

　　⑴保藏与传代：将测定用的金黄色葡萄球菌在新鲜斜面培养基上传代并保存。注意测定用敏感菌应每隔3周传代一次，菌种可在37℃温箱培养18～20h后，再在室温下置放3～4h，使菌种斜面产生良好的色素，然后将其置于4℃冰箱保存。

　　⑵活化：在使用前先将供试菌株在斜面培养基上连续传代3～4次，使菌种充分恢复其生理性状。

　　⑶制备悬液：将活化的敏感菌斜面，用0.85%生理盐水洗下，经离心后去除上清液，再用生理盐水洗涤1~2次，并将其稀释至一定浓度的悬液。

　　2.青霉素标准溶液的配制

　　(1)青霉素标准母液：准确称取纯苄青霉素钠盐15~20mg,，溶液在一定量的0.2mol/LpH6磷酸缓冲液中，使成2000U/ml的青霉素溶液，然后保持冷藏存放。

　　(2)青霉素标准工作液：使用时以标准母液配成10U/ml青霉素标准测定液，按表I-15-5-1加入青霉素标准母液，即配成不同浓度的青霉素标准液。

　　3.标准曲线的绘制

　　(1)倒底层培养基：取无菌培养皿16套，每皿移入20ml牛肉膏蛋白胨底层琼脂培养基，置水平待凝备用。

　　(2)铺含菌上层培养基：将装在三角瓶中的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(100ml)融化，待冷却到60℃左右时再加入60%葡萄糖液12ml和金黄色葡萄球菌菌液3～5ml(加入菌液的浓度应控制在使1U/ml青霉素溶液的抑制菌圈直径在20～24mm)，充分混匀后，用大口移液管吸取4ml于底层平板上迅速铺满上层，然后移置水平位置待凝备用。

　　(3)放牛津小杯：待上层充分凝固后，在每个琼脂板上轻轻放置4支牛津小杯，其间距应相等。

　　(4)滴加标准样品液：用无菌洁净移液管滴加标准样品液，每一稀释度应更换一支移液管，每支牛津小杯中的加量为0.2ml。或者用带滴头的滴管加样品液，加夜量如图所示，与杯口水平为准。每一稀释度做3个重复。

　　(5)培养：待样品加毕后，*好换上无菌素烧瓷盖(吸湿性号，在盖内不易形成水滴)做培养皿的盖子，并将平板置37℃温箱内培养18～24h后观察测定结果。

　　(6)测量与计算：移去测定培养皿的素烧瓷盖，再将牛津小杯移去，**地测量各稀释度的青霉素的抑制圈直径(用圆规两脚的针尖测量可提高精度)并记录于表中。

　　计算步骤：

　　① 算出各组(即各剂量)抑制圈的平均直径。

　　② 算出各组1U/ml的抑制圈平均直径。

　　③ 统计15套培养皿中1U/ml的抑制圈平均值。

　　④ 以1U/ml抑制圈的总平均值来校正各组的1U/ml抑制圈的平均值，即求得各组的校正值。

　　⑤ 以各组1U/ml的抑制圈的校正值校正各剂量单位浓度的抑制圈直径，即获得各组抑制圈的校正值。

　　举例：若30个1U/ml青霉素溶液的抑制圈直径的平均值为22.6mm。而**组内6个1U/ml青霉素溶液的抑制圈直径的平均值为22.4mm，则：

　　**组的校正值=22.6-22.4=+0.20(mm)。若��一组皿内0.4U/ml青霉素溶液的抑制圈平均值为18.6mm，那么**组0.4U/ml青霉素溶液的抑制圈校正值=18.6+0.2=18.8(mm)。

　　其他各组依次类推获得各自的校正值。

　　(7)绘制标准曲线：在对数坐标纸上，以青霉素浓度(对数值)为纵坐标，以抑制圈直径的校正值为横坐标，绘制标准曲线。

　　4.青霉素发酵液效价的测定

　　(1)青霉素发酵：用摇瓶或台式发酵罐法接种与培养产黄青霉(青霉素高产分泌菌株)

　　(2)稀释发酵液：作青霉素测定的发酵液用1%pH6.0磷酸盐缓冲液作适当稀释，每个被检验样品用3套培养皿测定其效价。

　　(3)放牛津小杯:每套含菌测定平半上均匀地放置4支牛津小杯，小杯中心坐落在培养皿两互相垂直直径的各自半径的中心。

　　(4)杯中加样品液：青霉素标准液(1U/ml)与发酵液的稀释液间隔地加入牛津小贝中，加液量务求准确，以降低操作误差。

　　(5)培养与测定：加完样品的平板放37℃下培养18～24h后，测量抑菌圈的直径并记录在下表中。

　　5.青霉素发酵液效价的计算

　　(1)求校正值：将青霉素标准测定也(1U/ml)在8套培养皿中抑菌圈的平均值曲线上1U/ml抑菌圈直径相互比较，以求得其校正值。

　　(2)校正发酵液的值：将此校正值校正被检发酵液抑菌圈直径，以求得他的近似效价值。

　　(3)查对标准曲线值：将此校正值在标准曲线上查得被检青霉素发酵液(稀释液)的效价单位。

　　(4)发酵原液的效价：将上述效价值乘上其稀释倍数，就可求得青霉素发酵液原液的效价值。