结核杆菌简介

　　结核杆菌正常典型的形态为细长微弯曲或直的、两端钝圆的杆菌，长约1—4微米，革兰氏染色阳性但色弱，是专性需氧菌，空气内加3%～5%CO2 为适宜的生长条件，在35～40℃ 范围均可生长，*适宜温度为37℃ 。它生长缓慢，培养时间一般需4～8周，至少也要3周。它的生物活性低，不发酵糖类，触酶活性很弱，68℃加热后丧失。结核杆菌根据致病性分为几型，引起人结核病的主要病原体是人型和牛型结核杆菌。结核分枝杆菌的特征之一是抗酸染色法染色能使菌体被染成红色，但不被酸性酒精脱色，故称为抗酸杆菌。

结核杆菌培养特性

　　(1)专性需氧。

　　(2)营养要求较高，培养常用罗氏培养基，内含蛋黄、甘油、天门冬素、马铃薯、无机盐及抵制杂菌生长的孔雀绿等物质。

　　(3)生长缓慢，繁殖一代需18～24小时，分离培养需经2～4周才可见米黄色菜花状菌落生长。

结核杆菌抵抗力

　　结核杆菌对酸、碱、自然环境和干燥抵抗力强，在干燥痰内可存活6～8个月。但对湿热、酒精和紫外线敏感，抵抗力弱，如75%酒精作用数分钟、液体中加热62～63℃，15min、直接日光照射数小时均可被杀死。对抗结核**易产生耐药性。

分子生物学方法检测结核杆菌

　　1、直接顺序法 对突变高发区城序列分析是鉴定突变的*直观可靠的方法，可以准确判定突变的有无及突变性质，也是其他快速间接鉴别方法的金标准。应用放射性同位素或荧光标记测序法，已发现许多突变位点及不同的氨基酸置换。突变在511～533这一区域内发生率达95%以上，其中以531，526，533，516四个位点*为常见。Williams研究了流行病学特征和结核杆菌利福平耐药突变性质之间的内在联系，认为突变位点及性质与耐药模式及程度，IS6110图谱及地位来源等无明显相关关系。但Taniguechi有不同意见，他研究结果表明513，526，531位点的突变导致对利福平高度耐药而其他位点则明显低度耐药或根本无耐药性。总之，直接测序可以得到突变详细资料，还可以对新发现突变进行鉴定，不足之处是仪器试剂昂贵，操作复杂，成本高，有放射性污染，不适于普遍推广应用。

　　2、多聚酶链式反应-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP) 其原理为根据在非变性聚丙烯酰胺凝胶中相同长度单链DN**段泳动距离的改变判定单个碱基变异。由于利福平耐药突变只在特定区域内发生，而通过PCR方法扩增这段基因，直接电泳判定突变有无，大大简化了突变分析操作。Telenti*先评估了放射性同位素标记PCR-SSCP方法的结核杆菌rpoB突变中的应用价值。所有利福平耐药菌株均成功地被检测出来，证明此方法特异准确。它可以同时进行大量临床标本筛选，使结果回报时间缩至48～72h。目前国内外本方法的研究较多，并已有成功用于临床痰标本及脑脊液标本检测的报道。SSCP方法为临床快速简便鉴定结核杆菌ropB基因突变开辟了新领域，尽管存在一定不足，如每次电泳均需有标准结核杆菌株对照及有时差异不易区分、不能鉴别沉默突变等，但仍不失为一种有广泛应用前景的方法。

　　3、双脱氧指纹图法(dideoxy fingerprinting，ddF) 在对PCR产和的进行ropB基因突变检测方法的研究中，Felmee应用了ddF法，这种方法结合运用了双脱氧末端终止法及SSCP法的原理，它将ropB基因片段复制产物做模板直接加入用于产生类似DNA测序产物的有放射性标记的不同长度的双脱氧末端片段，再行SSCP，经放射自显影后得出针对不同突变的特异的ddF。这样，如果有ropB基因突变，在SSCP电泳中不仅可以从因单链构象改变产生的泳动距离差异在SSCP中得以鉴别，同时由于其双脱氧末端终止位点不同于标准株，双脱氧末段片段数目也不同而得以区分。Felmee检测出了有不同突变(其中包括了80%已报道的ropB突变)的所有多耐药菌株，每一突变均有特异的ddF。在与SSCP分析法的对比研究中，认为ddF方法可以克服SSCP结果受电泳条件、电泳时间影响大，受突变性质(位点及突变碱基)影响大及不能区分出，在时间和成本上都有优越性，但未见有进一步临床应用情况的报道。

　　4、异源双链形成法(heteroduplex formation，HDF) HDF可用于检测DNA单个碱基突变或缺失，原理为突变基因与无突变基因PCR扩增产物混合，变性后使其温度缓慢下降，部分可形成分别来源于突变与敏感株基因的异源双链，同时有部分形成同源双链，电泳后可将二者区分开来，并且突变不同(如单碱基突变，插入或缺失)，形成的异源双链迁移距离也不同。Williams用HDF法进行了结核杆菌利福平ropB突变检测的尝试，110株RFP耐药株经HDF检测得到多条带形，证明有异源双链形成，而敏感株则只形成一条同源双链，HDF法与DNA测序法符合率达100%。这种方法操作简便，判定容易，不需放射性标记，适合应用于临床，但有关报道较少。

　　5、反向系列探针杂交法(Inno line probe assay，LiPA) LiPA方法基于探针杂交原理，先设计合成一系列探针，覆盖整个ropB突变高发区，其中S系列探针针对野毒株序列，R系列探针含数个有常见突变序列的探针，还可以设计一个有种属特异性的探针，将这一系列探针顺次固定于同一杂交膜上，在严格条件下与亲和素标记的PCR产物杂交，检测杂交信号，根据不同杂交带谱判定出突变有无及大致位置。这种杂交方法可以同时进行种属鉴定，检测试剂盒已有厂家生产，结果判定容易，特异性高，易于标准化。如Beenhouwer应用此法对临床痰标本的检测中与药敏结果对照有97%(65/67)的符合率。*近有学者应用此法同时对结核分枝杆菌进行种属鉴定及PCR敏感性测定，特异性达100%，对107株已知序列的结核杆菌临床分离株测定中，61株敏感株全部显示敏感型杂交带谱，203株耐药株除4株外均检测到突变带谱，误诊率下降到1.97%。不足之处是操作复杂，成本较高。

　　以上分子生物学方法对结核杆菌RFP耐药性检测应用中均有快速、准确，特异等优点，可在72h内报告结果，可以满足早期临床诊治需要，是结核杆菌RFP耐药性测定发展必然趋势。下一步研究重点是提高临床标本ropB基因扩增特异性(因其单拷贝存在于基因组中)，技术条件标准化、规范化，以及将耐药性诊断及种属鉴定同时进行的方法，使其能够成为直接应用于临床的有效方法。