霍乱弧菌的检测

　　1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。

　　悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查**的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。

　　2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。增菌培养孵育6h后，取表面菌膜移种于上述平板上，进行分离培养，并同时涂片，革兰染色和悬滴标本，检查形态及活动力。

　　各种分离培养的平板在孵育18~24h后观察菌落，挑取可疑菌落，先与生理盐水混匀，观察有无自凝现象。再用O1群霍乱多价血清做玻片凝集试验，立即出现明显凝集者为阳性，有条件者再做血清分型。

　　如在选择培养基生长典型菌落，运动活泼呈穿梭状，氧化酶阳性的革兰阴性弧形菌并与霍乱多价诊断血清凝集者，可判定为O1群霍乱弧菌。在霍乱流行期间，根据上述结果并结合临床即可对病人作出霍乱病的早期诊断。并立即向当地疾控部门报告信息。

　　注：霍乱弧菌诊断血清试剂的使用方法

　　于洁净玻片上滴1滴血清，然后取少量被检菌落与血清混匀，轻轻摇动玻片，1分钟内肉眼判断结果，试验应以生理盐水做阴性对照。

　　检验结果的解释：于1分钟内呈明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性。

霍乱弧菌检验流程

 　一、采样

　　(一)水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材;

　　(二)外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等;

　　(三)按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。

　　二、增菌、培养

　　(一)所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过****的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内);

　　(二)标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取**次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。

　　(三)霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。

　　三、快速诊断

　　(一)直接镜检：为争取*快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检(*好用暗视野)，可见具有流星状动力的**。

　　(二)早期玻片凝集试验：埃尔托弧菌在TCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快，37度培养8-10小时，在其他杂菌尚未生长或长出很小菌落情况下，埃尔托型菌落直径可达1-2mm。将已长出较大半透明菌落或湿润菌苔的平皿取出，直接用霍乱多价血清做玻片凝集，阳性者可初步报告。琼脂平皿继续培养，按常规培养时间再做一次复查。

　　(三)要求及注意事项：

　　1.当霍乱弧菌在4号琼脂及庆大霉素培养基上生长过久(超过36小时)时，会出现菌落粘稠、血清凝集假阴性现象。

　　2.故应取新鲜培养物(10-14小时)作凝集试验，凝集的菌落立即转种营养琼脂平板。

　　3.小川型菌株有时在稻叶型单价血清中可出现弱凝集，这并非彦岛型，而是小川型含有少量C抗原成分的缘故。

　　4.有的标本可能同时存在非O1群霍乱弧菌，可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查;

　　5.必要时，取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集(对一次流行的首批病人进行检验时尤应注意)。

　　6.平皿分离未获分散的单个菌落，而在密集部位仍有可疑菌落时，应将该部分再做分离或经增菌后再做分离;

　　7.从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌，这时应以霍乱粗糙型血清做玻片凝集，以确定是否为粗糙型或NAG弧菌。

　　四、初步鉴定试验：

　　1.氧化酶实验：在非选择性或非鉴别性培养基如营养琼脂的新鲜培养物上滴加氧化酶试剂1滴，并使其流开。或将菌落用竹签或牙签挑至滴有试剂的滤纸上，在1分钟内出现粉红-紫红-紫蓝色(有的*后呈黑紫色)。为氧化酶阳性。

　　肠杆菌科**多不变色或变成粉红色后很快退色为氧化酶阴性。

　　注意事项：试验时避开含铁物质(如接种环)。不能直接取产酸培养基上的菌落，不能取含还原剂的培养基及含亚碲酸盐培养基上的菌落(亚碲酸盐培养基可抑制氧化酶)，以免出现假阳性和假阴性。

　　2.拉丝实验：在玻片上加一滴试剂，取一接种环被检菌的新鲜琼脂培养物在试剂旁边研磨均匀，再与试剂混合制成浓厚悬液。阳性者很快(30秒内)由混变清并变得很粘稠，再用接种环挑取时，可以拉出细丝来。

　　阴性者呈均匀悬液状态，与蒸馏水对照相同。(古典型、埃尔托型和O139群霍乱弧菌均阳性。)

　　3.O/129(二氨基二异丙基喋啶)敏感试验：

　　用接种环或**棉拭子在含0.5%氯化钠的普通平皿上均匀涂抹待检菌，放上10微克、150微克O/129磷酸盐药敏纸片各一片，37度培养过夜。凡药敏纸片周围出现抑菌圈者为敏感。

　　古典型、埃尔托型霍乱弧菌二者均敏感;O139群霍乱弧菌10微克、150微克均不敏感。

霍乱弧菌检验质量控制

　　1. 用接种环取完标本、诊断血清、做完每一份标本实验等，接种环应严格在酒精灯火焰上**，避免交叉污染。

　　2. 玻片凝集试验阳性时，一定同时做生理盐水对照。在生理盐水中不凝集者，方可判断为阳性。

　　3. 标本、增菌管、培养平皿要严格编号，标识清晰，避免结果错报。

　　4. 诊断血清、培养基保存在指定温度范围内;诊断血清要在有效期内使用，培养基保存不超过一个月。

霍乱弧菌检验实验室**

　　1. 标本检测要穿实验专用服、戴口罩、手套，用过的口罩、手套放黄色污物袋中，及时高压处理。

　　2. 用过的玻片及时放入**缸中浸泡;实验完毕，用浸泡**液的抹布擦拭实验台面，或紫外线照射**。

　　3. **制品要有有效的批准文号，在有效期内使用。 配制的**使用液，要表明配制日期。

　　4. 标本、培养物、实验废弃物等，要经高压**处理后，方可丢弃。