摘要：该试验旨在研究病原菌感染与奶牛**炎发病之间的关联性。根据细菌分离鉴定程序和菌落总数计数法测定了６３６份乳样，涉及无**炎乳、不同等级的隐型**炎乳、临床型乳。结果表明，该牧场奶牛所患的**炎是以单种细菌感染为主，并且在一定的细菌感染比例下，**炎的发病程度与杆菌的相对比例正相关，与葡萄球菌的相对比例负相关；同时，**炎的发病程度还与菌落总数的含量正相关。无**炎乳、隐型**炎乳、临床型**炎乳中的菌落总数差异极显著（Ｐ＜０．０１）。结果提示，本场**炎的发病程度与杆菌所占的比例和菌落总数成正相关关系。
关键词：细菌；**炎；菌落总数
高度集约化奶牛场奶牛**炎病原菌的分离计数及感染规律
（１．扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州２２５００９；２．上海牛奶集团，江苏大丰２２４１００）
**炎是危害奶牛养殖业*常见的**之一，可以导致**炎的因素虽然有很多，但微生物污染是引起**炎*主要的病因，因此对乳汁进行细菌的分离鉴定和菌落计数，能够较直观的了解奶牛**炎的发病原因，有助于对**炎进行早期控制、帮助兽医准确的判断病情并对其对症**或者淘汰。虽然国内众多研究者对奶牛**炎的细菌感染情况进行了研究，对该病的防治起了很积极的作用，但他们的结果也表明了不同的地区病原菌的发病情况存在着十分显著的不同［１］。有鉴于此，本试验旨在探索在高度集约化养殖条件下奶牛病原菌感染与**炎发病程度之间的关系，为生鲜乳的质量控制提供可操作素材，并为牧场**炎的防控和对症**提供相应的理论支持。
１ 材料与方法
１．１ 牛群及饲养管理 选取靠近海边的某大型集约化奶牛场，本场牛群为进口澳大利亚荷斯坦奶牛，平均胎次为２到３胎，ＴＭＲ全价日粮，散栏饲养，自
由采食，采用现代化转盘机械挤奶，牛床铺垫干燥过的木屑，污水粪尿由自动刮粪板定时清理干净，全场定期****。
１．２ 试验仪器 电热鼓风干燥箱，电热恒温培养箱，立式压力蒸汽**锅，打孔机，显微镜，震荡仪，超净台、天平、分析天平。
１．３ 培养基 血清肉汤培养基、血平板、麦康凯琼脂培养基、却甫曼培养基、平板计数琼脂培养基。
１．４ 试验方法
１．４．１ 兰州隐型**炎测试液（ＬＭＴ）测试 先擦拭**及**，弃去前３把乳汁，再将各乳区的乳样挤在对应的盘中，诊断盘倾斜４５℃，弃去多余乳汁，诊断盘中各乳皿大约２ｍＬ乳样。每个样品加２ｍＬ ＬＭＴ诊断液与蒸馏水以１∶３混合后的稀释液。之后做水平样同心圆摇动，上下倾斜摇动数十秒后作判定。ＬＭＴ诊断液与乳汁混合后按凝胶反应的程度分为“－”乳样、隐型“＋”乳样、隐型“＋＋”乳样、隐型“＋＋＋”乳样、临床型乳样。
１．４．２ 病原菌的分离鉴定 （１）乳样的采集：**按常规挤奶**程序，挤奶后采样，标明牛号、乳区，放入有冰袋的泡沫盒中，３ｈ内送检；（２）增菌培养：对采集的乳样摇匀后，在无菌环境下吸取１ｍＬ至血清肉汤培养基中，１５０～１６０ｒ／ｍｉｎ离心，３７℃恒温摇床过夜；（３）分离鉴定：摇匀乳样，将每份乳样接种于血平板中，放置于３７℃恒温培养箱培养，２４ｈ后观察细菌的培养特性，根据菌体形态、溶血情况及染色特性初步判定细菌类属［２－４］；（４）革兰染色及镜检：对每一个菌落进行革兰染色镜检，初步区分细菌
革兰染色的阴性和阳性。根据菌落的生长特性和镜检结果将其分为葡萄球菌类、杆菌类、链球菌类、酵母类等。对于血平板上不能确定的菌落，对其在鉴别培养基上培养。按编号详细记录主要病原菌的鉴别结果，并整理每头牛、每个乳区主要病原菌的鉴别结果。具体操作为：准备好透明清晰洁净的抹片、滴上**水后均匀的涂布菌落、自然干燥后火焰固定，之后进行革兰染色，即可进行显微镜观察。革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。根据菌体形态、溶血情况及革兰染色特性初步判定细菌类属。
１．４．３ 菌落总数的测定 以无菌吸管吸取２５ｍＬ奶样注于盛有２２５ｍＬ生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成１∶１０的样品匀液。用１ｍＬ无菌吸管吸取１∶１０样品液１ｍＬ，注于盛有９ｍＬ稀释液的无菌离心管中，反复吹打使其混合均匀，制成１∶１００的样品匀液，重复稀释步骤，制备１０倍系列稀释液。选择适宜稀释度的样品匀液，取１ｍＬ样品匀液于无菌平皿内，将１５～２０ｍＬ营养琼脂（保育后温度以不烫手为宜）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，３７℃培养４８ｈ。培养结束后肉眼观察计数，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落总数以菌落形成单位表示。
２ 结果与分析
２．１ 隐型**炎检测 对本群体转盘奶牛进行全区普测，共检测奶牛总计３ ４０２头，１３ ６０８个乳区，隐型**炎检测结果见表１。
２．２ 细菌分离鉴定结果 按照隐型**炎测试的分级结果对亚临床型**炎的牛群进行采样，并区分乳区，对有临床型**炎的奶牛同时取样，在６３６
份奶样中分离到的３种主要病原菌共５４５例，其中葡萄球菌１６５例，占分离菌株的３６．２％；杆菌２０５例，占分离菌株的４５％；葡萄球菌和杆菌混合感染７３例，占分离菌株的１６％。葡萄球菌和链球菌混合感染８例，占分离菌株的１．８％，杆菌和链球菌混合感染２例，占分离菌的０．４％，葡萄球菌、杆菌和链球菌混合感染３例，占分离菌的０．７％，没有发现链
球菌单独感染的情况。鉴定结果见表２、表３、表４。
由此可以看出，本场奶牛**炎以单种细菌感染为主，占５８．２％，并且随着**炎情况的加重，不同细菌的比例也会有规律的变化：从阴性乳到临床
型**炎乳，葡萄球菌的比例在下降，杆菌的比例在上升。到临床型**炎时，杆菌的比例甚至已经达到了葡萄球菌的４倍，初步可以判断出本场受杆菌类的环境致病菌的影响较强，这个结果也符合牧场方对该场细菌感染模式的判定。
２．３菌落计数结果 对阴性乳，分等级的隐性**炎乳和临床型**炎乳，分别按照国标对其进行菌落总数的计数，其结果见表５、表６
。
３ 讨论
据国际奶牛联合会的资料统计：隐型**炎在产奶牛中的患病率达５０％，西欧部分经济发达国家奶牛隐型**炎的发病率为２５％［５］，我国奶牛的乳
中国兽医杂志２０１３年（第４９卷）第７期２５房炎发病率高于世界平均水平［６］，包括隐型**炎在内的发病率平均为７０％。但对本场３ ４０２头转盘挤奶的奶牛进行**炎检查，**炎头数发病率为１８．７％，乳区发病率为８．３２％，远低于国内平均水平。造成本场这种低水平**炎的原因很多，可能是以下几种因素综合作用的结果：（１）有研究证明［６－８］不同胎次的奶牛发病率差异极显著（Ｐ＜０．０１），本场奶牛主要是２～３胎次，**受损的情况比较轻。（２）牛群的ＢＣＳ评分大部分集中在２．６～３．４岁之间，处于*健康的体况范围。（３）在挤奶方式上采用现代化转盘机械挤奶，有效地保护了乳腺，减少了人为原因造成乳区物理性伤害。（４）牛舍环境卫生条件较好，减少了微生物的生存空间。及时检出及**发病牛只，切断了传染性细菌的传播链。
国内外公认隐型**炎的主要致病菌为葡萄球菌、链球菌及大肠杆菌，以上３者共占总检出菌的９０％以上。通过对本场奶样细菌的分离鉴定，确定本场的细菌感染主要是葡萄球菌（４５．７％）和杆菌（５１．９％），并且绝大部分是单种细菌造成的感染。隐型**炎“＋”的奶样发病程度较轻，它和阴性奶中的杆菌与葡萄球菌的相对比例相差不大，都约为０．５７％～０．６％，隐型“＋＋”的奶样中杆菌与葡萄球菌的的相对比例为１．３５％，隐型“＋＋＋”奶样中的杆菌与葡萄球菌的相对比例为１．４４％，而到了临床型**炎时，杆菌与葡萄球菌的相对比例甚至达到了４．０％，我们可以很明显的看到，在一定的细菌感染比例下，**炎的发病程度与杆菌相对比例正相关，与葡萄球菌的相对比例负相关。此外，**炎的发病程度还与菌落总数的含量正相关，随着菌落总数的增加，**炎的程度也增加，据本场的统计结果显示，阴性奶中的菌落总数均值为６．９×１０４ ＣＦＵ，而隐型“＋”的奶样中菌落总数达到了２．６×１０５ＣＦＵ，隐型“＋＋＋”的奶样中菌落总数达到了１．５×１０６ ＣＦＵ，临床型奶样中的菌落总数更是达到了２．４×１０６ ＣＦＵ，不同程度的**炎乳中菌落总数的差异极显著（Ｐ＜０．０１）。此外，通过表６的数据我们也可以看出，不同程度的**炎乳样对杆菌和葡萄球菌含量的影响几乎也全部都为极显著（Ｐ＜０．０１）。
本试验的结论在一定程度上给牧场提供了控制**炎发病率的思路，通过有针对性的抑制杆菌的生存、传播、感染等，并降低**内的菌落总数，可以有效地抑制**炎的发病情况，为生鲜乳生产的质量控制提供可操作素材，而良好的奶源是上等乳产品生产的保证，这种通过饲养阶段关键节点的控制生产上等的生鲜乳是一种十分值得提倡和推广的途径。
—高度集约化奶牛场奶牛**炎病原菌的分离计数及感染规律