寡核苷酸的四大功效

　　1、从动物中提取的寡核苷酸首先从基因营养入手，提高基因的自我修复能力，使发生突变的**易感基因快速恢复正常，这就从源头上预防**保持健康，从根本上对心脑血管病、糖尿病、肿瘤等老年慢性病具有良好的功效。

　　2、降低人体对**的耐受性、提高**的利用率，提高药效的4.9倍;同时有效化解**的毒副作用。

　　3、通过阻断病毒基因，控制病毒复制转录全过程，激活拓朴异构酶，使基因排列更整齐。

　　4、化解肝脏中的各种生物、化学**并排出体外，从根本上改善肝脏的功能，大量分泌酶，提高人体对营养物质的消化吸收，**改善人体的健康状况。

寡核苷酸的固相化学合成

　　一、寡核苷酸的固相化学合成历史

　　寡核苷酸的化学合成起步于20世纪四十年代末。

　　1955年，剑桥大学的Todd实验室成功合成了具有磷酸二酯键结构的TpT,并获得1957年诺贝尔奖。

　　1965年，Khorana等利用化学方法大量合成脱氧核苷的单一聚合物或二种、三种脱氧核苷的重复序列，人工合成的六十四种核糖三糖苷，研究蛋白质的生物合成过程，从而确定了氨基酸的三联密码子，因此而获得1968年诺贝尔奖。

　　六十至七十年代，寡核苷酸的化学合成方法不断完善，逐渐形成了今天被广泛应用的固相亚磷酸三酯法并实现了合成的自动化。

　　DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相磷酰亚胺法为基础设计制造的。

　　二、 合成的原理和方法：

　　核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到*终产物。

　　固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3’-OH与固相载体成共价键，5’-OH被4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护，下一个核苷酸的5’-OH亦被DMTr保护，3’-OH上的磷酸基上有—N(C3H3)2和—OCH3两个基团，每延伸一个核苷酸需4步化学反应。

　　(1)脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三***/二氯甲烷溶液脱去，游离出5’-OH。

　　(2)综合新生成的5’-OH在四唑催化下与下一个核苷3’-磷酰亚胺单体缩合使链增长。

　　(3)盖帽有少量(小于0.5%)未缩合的5’-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。

　　(4)氧化新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。

　　上述步骤循环一次，核苷酸链向5’-OH方向延伸一个核苷酸。

　　三、合成后处理

　　合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保护基封闭着，要经过以下合成后处理才能*后应用。

　　(1)切割 合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来。切割后的寡核苷酸具有游离的3’-OH。

　　(2)脱保护切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去。磷酸基的保护基B—氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丙酰基则要在浓氨水中55℃放置15小时左右方能脱掉。

　　(3)纯化纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，盐及各种保护基等杂质。通常采用的纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。纯化这一步操作是可以选择的，对要求不高的应用如PCR等可不纯化。

　　近年来发展了一些修饰试剂，可以在合成寡核苷酸时，对某些核苷酸进行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新的途径。

寡核苷酸的制备与纯化

　　一、寡核苷酸的制备

　　DNA的合成有磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法等，现在常用的是固相亚磷酰胺法，它具有快速、方便、偶联效率高等特点。一般从3′向5′合成，通过下列四个步骤加上一个核苷酸。

　　**步，脱保护：用三***或二***脱去连在固相载体上的核苷酸5′羟基上的保护基团DMT，使它暴露出来进行下一步反应。

　　**步，偶联：将亚磷酰胺单体用四唑活化，形成高反应性的亚磷酰四唑，进入合成柱，与连在固相载体上的寡核苷酸5′羟基偶联，这一步效率一般在98%以上。

　　第三步，封闭：为了防止少量未反应(<2%﹞的连在固相载体上的5′羟基进入下一循环，用醋酐对其进行乙酰化封闭，大大提高了*后产品的纯度。

　　第四步，氧化：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酯转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

　　经过上面四个步骤，核苷酸被逐个加到合成的寡核苷酸链上。*后用浓氨水把寡核苷酸从固相载体上切割下来，脱去碱基和磷酸基团上的保护基团，随后进行纯化和定量。

　　二、寡核苷酸的纯化方法：

　　寡核苷酸的纯化常用的方法有OPC，HPLC，PAGE，C18等方法。OPC柱中装有对DMT具有亲和力的树脂，合成DN**段时保留5'端*后一个碱基上的DMT，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有DMT的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三***TCA脱去DMT基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。这种方法的优点是快速，简易。但是其专一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。利用离子交换或反相HPLC纯化寡核苷酸是国外公司常用的方法，它具有自动化程度高、快速、简便的优点，缺点是需要仪器，对长片段效果不理想。PAGE纯化是利用长短片段带的电荷不同，电泳迁移率不同来分离不纯物和产品，它的优点是产品纯度高、质量可靠，是国内许多公司推崇的方法，缺点是实验步骤多，费人工。本公司利用PAGE纯化产品，然后用C18脱盐，也可按照用户的要求对修饰的寡核苷酸进行HPLC纯化。

　　三、寡核苷酸的定量：

　　Oligo DNA是以OD260值来计量的。在1cm光程标准石英比色皿中,260nm波长下吸光度为1的1毫升Oligo溶液定义为1 OD260。虽然对于每种特定的寡核苷酸来说,其碱基的组成不尽相同,但1 OD260 Oligo DNA的重量约为33 μg，每个碱基的平均分子量约为330 Da。因此合成的Oligo DNA摩尔数可按以下公式近似计算：

　　摩尔数(μmol)=[OD值×33]/[碱基数×330]

　　四、溶解和保存寡核苷酸：

　　本公司提供的是真空干燥的DNA，呈干膜状或粉末状在离心管底部，可以-20℃或室温长期保存。开启瓶盖时小心不要丢失，请先稍微离心，再加入足量的水充分振荡溶解。溶解DNA的水*好无菌，pH大于7.0。要溶解成所需浓度的寡核苷酸，可按下式计算加入ddH2O的量： 所需水的量(ml)= [OD值×33]/[(碱基数×330)×所需浓度(μM)]溶解好的DNA*好保存在-20℃，带有荧光标记的引物请注意避光保存。