蛋白质二级结构是多肽链通过氢键连接盘旋而形成的结构,包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲4种结构,其中前两者为规则有序结构,后两者相较于前两者表现得更加无序。当蛋白质受到外界条件影响时,蛋白质二级结构会发生一定程度的改变,从而导致其功能特性发生变化,如凝胶性、持水能力、溶解性、乳化性和流变性等,因此研究蛋白质二级结构的变化,有助于预测蛋白的功能特性,进而了解原料的加工特性。
目前国内外研究蛋白质二级结构的方法有傅里叶红外光谱法、拉曼光谱法、X-射线衍射法、圆二色谱法以及核磁共振法,其中傅里叶红外光谱法和拉曼光谱法是*常用的方法。
傅里叶红外光谱法测定蛋白质二级结构的方法及优缺点
傅里叶红外光谱法可检测不同状态的蛋白样品,包括固体样品和液体样品,但因水在1640cm-1附近的吸收会对测定产生强大干扰,因此通常情况下固体样品更多被选择。固体样品制备方法有很多,*常用的是KBr压片法。样品薄片制备后,置于红外光谱仪中进行测定,常用的测定参数为:扫描范围400~4000cm-1,以KBr空白片做参比,分辨率设置为4cm-1,扫描次数为128次,得出图谱。将图谱在傅里叶红外光谱仪中进行初步处理,用OPUS软件进行基线校正、去卷积以及二阶导数拟合(直至R2不变为止),确定各个子峰与二级结构对应关系,根据各子峰面积百分比计算各部分二级结构含量,每组样品平行测定多次,取平均值。
傅里叶红外光谱法具有操作简单、灵敏度高、分辨率好、扫描速度快、信噪比高、能检测蛋白质结构微小变化等特点。有如下优势:
(1)不受官能团、相对分子质量等条件限制,测定样品量少,对样品没有特殊要求,可以对水溶液、晶体和固体中的蛋白质进行构象分析,可鉴定多种成分。
(2)傅里叶红外光谱法应用范围广,不但能够直接进行检测分析,还可以跟其他色谱、质谱仪联用,极大提高了检测准确性。
(3)不受其他物质干扰,可从复杂的物质体系中快速识别目标物质,且无需重复检测,检测重现性好。
但由于整个系统设备体积大、价格高、测量气体样品时易受其他气体干扰,使用压片法测量时制得的样品易碎且必须严格干燥,增加了操作的复杂性。
拉曼光谱法测定蛋白质结构的方法及优缺点
采用拉曼光谱法检测蛋白样品时,与傅里叶红外光谱法不同,蛋白提纯后可直接置于拉曼光谱仪中进行测定,常用的测定参数设定为:扫描波长为785nm,激光功率为300mW,扫描范围:400~4000cm-1,扫描时间每次60s,4次扫描进行累加,以苯丙氨酸[(1003±1)cm-1]作为归一化因子,并用显微镜进行观察,将光谱用Origin8.5进行平滑处理,采用OPUS软件进行拟合分析并通过峰面积比得到各二级结构含量。
拉曼光谱法具有灵敏度高,样品量少(μg级),分析速度快、操作简单快速等特点,可进行无损分析,试样可直接通过光纤探头进行测量。有如下优势:
(1)此方法对样品状态不设限制,可检测固、液、气多种状态样品物质。
(2)拉曼光谱法无需对样品进行预处理,样品可在其本征状态下直接进行测试,避免了对样品的破坏及检测过程中人为导致的误差。
(3)由于水的拉曼散射很弱,因此拉曼光谱法非常适合研究水体系,且在进**体检测时,无需分离样品气体,可同时检测多组分气体样品,大大节约了时间成本。
傅里叶红外光谱法和拉曼光谱法已成为表征蛋白质二级结构强有力的工具,通过对图谱的处理分析,可获取蛋白质二级结构信息。但这2种方法各有优缺点,傅里叶红外光谱法更适合干燥易磨粉的样品,拉曼光谱法则对样品状态没有限制。