荧光显微镜的原理

荧光显微镜的原理
                                                                        荧光显微镜的原理

在装置上的重要部件就是要有能提供充分的特定波长的光源装置，使被检物体得到理想的激发而发出强的荧光。为达到这一要求，均借助滤光片把激发光的光谱限定在这一特定波长区域内，而把伴随时发出的可见光全部吸收或反射掉。 

荧光显微镜的装置有透射式和落射式两种类型。 

(一)透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗场聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视场背景。透射击式不适用于非透明的被检物件。 

(二)落射式：新型的荧光显微镜多为落射式，在光路中具有分光镜，光源是自被检物体的上方，故对透明的被检物体都适用。由于物镜起到了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明，但它在低倍情况下则暗，而高倍则明。 

荧光显微镜的特殊结构包括： 

(一)滤色系统 

滤色块是荧光显微镜的重要部位，其核心部件由激发光滤色片(first barrier filter)、发射光滤色片(second barrier filter)和半透半反滤色片(beam-splitting mirror)组成。各厂家的滤色片型号、名称常不统一。­­­­ 

1.激发光滤色片及发射光滤色片：根据光源和荧光色素的特点，通常选用以下三类配套，提供一定波长范围的激发光，并使样品激发出的荧光透过，到达目镜成像。 

紫外光激发：激发光滤色片可使紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。与之相应的发射光滤色片可允许蓝光通过，视野内的光呈蓝色，如应用于DAPI染色。 

蓝光激发：激发光滤色片可使蓝光通过，阻挡其他波段的光。与之相应的发射光滤色片可允许绿光通过，如GFP 染色标记。 

绿光激发：激发光滤色片使绿光通过，阻挡其他波段的光。与之相应的发射光滤色片通常可允许红光通过，如Rhodamine染色。 

2.半透半反滤色片：它的作用是完全阻挡激发光通过，而将其反射;并透过相应波长范围的发射光。其型号与激发光滤色片和发射光滤色片相对应。 

(二)物镜及目镜 

各种物镜基本可以应用，但*好选用增称、消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能(波长范围)适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其对荧光不够强的标本，应使用镜口率大、光透过性高的物镜，配合以尽可能低倍的目镜。 

(三)其他光学装置 

反光镜，其反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上(而银的反射率只有70%)。一般使用平面反光镜。聚光镜，专为荧光显微镜设计制作的聚光镜用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。落射光装置，它除具有透射式光源的功能外，更适用于不透明及半透明标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养等样品的直接观察。近年研制的新型荧光显微镜多采用落射光装置，称之为落射荧光显微镜。 

(四)光源 

现在多采用50或100W的高压汞灯作光源。工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高(这一过程一般约需要5～15min)，并在这一过程中发射光量子，释放的光的波长足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。 

汞灯的使用寿命较短，通常为200hrs，针对这种使用寿命上的限制，近几年，一种新型荧光光源X-Cite以2000hrs超长的灯泡寿命，及灵活的使用——无需预热，即开即用而被广泛使用。