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如何避免IP检测过程中的重、轻链干扰?

免yi沉淀 (Immunoprecipitation,IP) 是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与ProteinA/G偶联的agarose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
在免yi沉淀实验后的WB验证环节中,当使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗时,通常会出现对应免yi沉淀一抗变性后产生的重链(50kDa)和轻链(25kDa)两条带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时,就会受到这两条带的干扰。






如何避免IP检测过程中的重、轻链干扰,两种方案可供参考:
方案一:选择WB一抗时,选择和IP用一抗不同的种属,避免IP一抗的干扰
山羊抗兔IgG二抗,HRP标记,货号:AMJ-AB2003


方案二:选择只和重链或轻链反应的二抗
IP™ 山羊抗小鼠IgG轻链二抗,HRP标记,货号:AMJ-AB2016
IP™ 山羊抗兔IgG重链二抗,HRP标记,货号:AMJ-AB2019
如果目标蛋白分子量小于30KD,为了避免抗体轻链的干扰,选择重链特异性二抗;如果目标蛋白分子量大于30KD,为了避免抗体重链的干扰,选择轻链特异性二抗。


IP实验常见问题汇总:


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