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细菌的革兰氏染色和特殊形态观察

实验原理

染色方法：
革兰染色法是细菌学中*广泛使用的一种鉴别染色法。1884 年由丹麦医师 Gram 创立。方法是先将细菌用结晶紫染色，加媒染剂（增加染料和细胞的亲和力）后，用脱色剂（酒精或丙酮）脱色，再用复染剂染色。如果细菌不被脱色而保存原染液颜色者为革兰阳性菌(G＋)；如被脱色，而染上复染液的颜色者为革兰阴性菌(G-)。此染色法可将所有具有细胞壁的细菌分为两大类：革兰阳性菌和革兰阴性菌。

单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。

复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。

染色原理：现在认为细菌对革兰染色的不同反应主要是革兰阳性菌和阴性菌的细胞壁结构与化学组成不同。革兰阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量多，且交联度大，脂类含量少，经 95％乙醇脱色时，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，与细胞结合的结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细胞仍保留初染时的颜色。而革兰阴性菌的细胞壁较薄，含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少，乙醇脱色时溶解外层类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染的颜色。

实验试剂

革兰氏染色液一套
结晶紫
碘液
95%乙醇
番红花红
孔雀绿

实验设备

显微镜
盖玻片
载玻片

实验材料

菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌

实验步骤（细菌的革兰氏染色和特殊形态观察）

1. 革兰氏染色
（1）涂片

（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。

（3）媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。

（4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。

（5）复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。

（6）镜检：观察染色结果并绘图。

2. 染色过程：涂片（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（结晶染色过程：紫染色 1min）→媒染（碘 1min）→水洗→95%乙醇脱色（1min）→复染（番红花红染色 1min）→干燥→镜检（油镜）

3. 油镜的使用与保养
（1）在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。
（2）用双眼观察目镜，并慢慢转动粗调节器至出现模糊物象，然后用细调节器至物象清晰为止。
（3）如果不出现物象或者目标不理想要重找。
（4）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许乙醇将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。

注意事项

1. 菌种应选用对数期的菌种；
2. 涂片不易过厚，涂片薄而均匀为好；
3. 脱色不足或脱色过度均会造成革兰染色的假阳性或假阴性，脱色时间取决于涂片厚度、室温等；
4. 实验结束请确保油镜头擦拭干净。

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