实验一质粒的提取和纯化
实验目的：了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。
实验原理：质粒DNA的抽提是基因工程操作中*常用与*基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。*常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol／L尿素，0.24mol／L磷酸缓冲液pH＝6.8)只吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链)等。本实验选做的是碱法。
1.裂解细胞 裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有TritonX-100等。
2．分离 即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。
3．纯化 细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰RnaseA分解除去。蛋白质可通过酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿／异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。
正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿（(1:1)）一氯仿（或氯仿／异戊醇24:1)，处理，根据实验情况也可考虑省略**或**步，但切记不可将氯仿（氯仿／异戊醇）的处理步骤省略掉DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将
实验内容：
试剂
1.LB培养液(1L)
**培养用蛋白胨 10g
**培养用酵母粉 5g
NaCl 10g
用10mol／LNaOH调至pH7.0，高压蒸气**, 4℃贮存.
2．溶液Ⅰ，可成批配置，**后4℃贮存。
葡萄糖 | 50mmol／L |
Tris-C1(pH8.0) | 25mmol／L |
EDTA | 10mmol／L |
3．溶液Ⅱ(新鲜配制)
NaOH 0.2mol／L
SDS 1％
4．溶液Ⅲ
5mol／LKAc | 60ml |
冰醋酸 | 11.5ml |
水 | 28.5ml |
配制好的溶液Ⅲ含3mol／L钾盐，5mol／L 醋酸(pH4.8)
卡那霉素(Kana):50mg/ml, 过滤**.
5．重蒸酚 市售苯酚蒸馏纯化(收集179～181℃之间的酚)后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以上，4℃保存。
6．氯仿 异戊醇(24:1)
7．无水乙醇
8．RNaseA(10mg／ml)
9．3mol／L NaAc(pH5.2)
10．TE 10mmol／L Tris-C1(pH8.0) 1mmoI／L EDTA
材料
含有质粒(pNTE-EGFP,pEGFPN3)的大肠杆菌DH5a.
操作步骤
1．挑取琼脂培养板上的含有pNTE-EGFP, pEGFPN3质粒的单菌落，接种至5ml LB培养液(含Kana 50μg／m1)，37℃振荡培养过夜。
2．取出1.5ml培养液至1.5ml离心管中，12000r／min离心2min，弃上清。
3．将**沉淀重悬于100μl预冷的溶液工中，强烈振荡混匀。
4．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖，轻轻颠倒混匀5次，冰浴5min。
5．加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10s，冰浴5min。
6．12 000r／min室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5m1 Eppendorf管中。
7．加入等体积酚／氯仿(1:1)，振荡混匀，12000r／min离心2min，上清转移至另一个Eppendorf管中。【注意】酚具有腐蚀性，操作时小心。
8．加人等体积氯仿，振荡混匀，12000r／min离心2min，上清转移至另一个Eppendorf管中。
10．加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃沉淀10min。
11．12000r／min离心10min，去上清，沉淀用70％乙醇洗涤一次，空气中晾干。
12．加入20μl TE溶解质粒DNA，加入RNaseA，终浓度20μg／m1 37℃水浴0.5h。
13经0.7％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后观察抽提结果。【注意】EB为致癌物，操作时一定要戴乳胶或一次性手套。
14．将该管质粒保存于-20℃备用。
注意事项
1．该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净，获得一定得率的质粒DNA。去掉染色体DNA*为重要，也较困难，因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂解成小片段，从而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶液Ⅰ加入时可用力振荡几次，因为此时**还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，加入SDS后，则要注意不能过分用力振荡，温和混匀,但又必须让它反应充分。加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液溶液III,同样处理!
2.加入溶液I之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出.
2．加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖倒翻摇动4～5次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA。
3．乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出)。否则，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不完全。
4．为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带，加入1μlRNA酶，将管置50℃水浴箱内30min，消化RNA。
6．抽提产物经电泳分离、EB染色后，在紫外线灯下可观察到三个条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒DNA。