怎样选择色谱柱
现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但
是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。
1、正相色谱
正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团
(NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品
中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份*先被冲洗出色谱柱。
正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿
（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反相色谱
反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。
反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。
样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合*先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有
更强的保留。
常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。
二、聚合物填料
聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～
14均可使用。
相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白
质等样品的分离非常有效。
现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。
三、其他无机填料
其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般**于特殊的
用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基
键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基
键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由
于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，
氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。
但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，
新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应
用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难
度，其重要用途与优势尚在进行中。
怎样选择填料粒度
目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、
5um和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填
充柱的柱效越高；小于3um的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，
但不是**的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料
是很有用的，3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，
3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更
短的色谱柱，以缩短分析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使
用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。
一、如何保证良好的柱性能与柱寿命
◆认证阅读色谱柱使用说明书；
◆使用填充良好的色谱柱；
◆尽量减少压力波动，避免机械及热冲击；
◆使用保护柱及在线过滤器；
◆经常以强溶剂冲洗色谱柱；
◆充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分；
◆用稳定的固定相（C18*稳定）；
◆在中等PH值操作（6~8），用有机缓冲溶液；
◆色谱柱使用温度*好小于40℃；
◆硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0；
◆在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；
◆流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%；
◆过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴*好）。
HPLC固定相及应用范围
名称 别名 功能基团 正相 反相 离子对 应用 |
Silica -OH √ 非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。 |
SAS C1 -(CH3)3 √ 在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留* 弱，典型用于中等极性和多官能团化合物. |
Butyl C4 -C4H9 √ √ 分离肽和蛋白质，保留时间比C8和C18短。 |
MOS C8， -C8H17 √ √ 中等极性相中对中等化合物，小肽和蛋白质， Octyl 极**族化合物和环境样品。 |
ODS C18 -C18H37 √ √ 烷基键合相中对中等极性化合物保留*强。广 泛用于**，甾族化合物，脂肪酸和环境样品. |
CPS CN ,Cyano -(CH2)3CN √ √ 对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相 (propyl 分离，当用于反相系统时，其选择性与 C8和 Nitrile) C18不同，在药学领域和复杂混合物的分离中应 用广泛。 |
APS NH2 -(CH2)3 NH2 √ √ 反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交 (Amino Propyl) 换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性 剂 做流动相。正相中与硅胶的选择性机改性剂 不同,分析芳香族效果很好。 |
Phenyl -(CH3)C6H5 √ √ 芳香族化合物 |
Diol -(CH2)2O √ √ 反相时，分离肽和蛋白质。正相时，与硅选择 CH2(CH2OH)2 性 相似,但极性较弱。 |
SCX 强阳离子 -(CH2)2C6H4SO3H- √ 有机碱 交换 |
SAX 强阴离子 -(CH2)3N+(CH3)3 有机酸，核苷和核苷酸 交换 |
二、如何解决色谱柱使用过程中出现的问题
1.保留值与分离度重现性不好原因分析
问题 原因 表现 |
不同色谱柱间差异 填料、键合相不同 保留因子（k），分离因子（α） 使用期间柱变化 柱床破坏 柱效（N） 键合相丢失 保留因子（k），分离子（α） 硅胶基质溶解 柱效（N） 强保留分堆积堵塞 保留因子（k），柱效（N） |
柱外效应 系统差异，进样量大、 柱效（N） 进样阀与 色谱柱之间、 色谱柱与检测器之间管 路太长、检测器流通池 体积大、接头死体积大 等。 |
分离效果变差 流动相组分改变 保留因子（k），柱效变化很小 流速改变 保留因子（k），分离因子（α） 温度改变 保留因子（k），柱效变化很小 |
柱平衡慢 重新平衡时间不够 保留因子（k），柱效变化很小 |
柱超载 样品量太大 保留因子（k），柱效（N） |
2.造成色谱峰（不对称）拖尾的原因
1.色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷；
2.柱头有污染；
3样品超载；
4样品溶剂不合适；
5.柱外效应；
6化学或二次保留（硅羟基）效应；
7缓冲容量不足或不合适；
8重金属污染。
3.如何解决峰形拖尾的问题
A．与化学有关的拖尾问题
1．流动相中，加入30mM的三乙胺（用与碱性化合物）或醋酸胺（用与酸性化合物），未
知化合物加醋酸三乙胺；
2．如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；
3．降低进样量至<1ug。
B．与色谱柱有关的拖尾问题
1．如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲
醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗，正向柱可用甲醇冲洗。
2．使用保护柱
C．与HPLC 系统有关的峰拖尾和峰加宽
1．进样体积过大，（通常≤25uL）；
2．进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（*佳连接管应<<st1:chmetcnv unitname="cm"sourcevalue="20" hasspace="False" negative="False" numbertype="1"tcsc="0" w:st="on">20cm，内径为0.007″）；
3．检测器流通池的体积过大。
4．如何储存色谱柱
1．防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制**成长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中加20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。
2．尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂（乙晴*好）中，避免在缓冲溶液中保存。
3．使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂储存。
4．避免用纯净水冲洗键合致密的C18柱。
5．将色谱柱的两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。
如何选择保护柱
怎样选择保护柱，但又不能影响分离分析？这是色谱工作者经常提出的一个问题。通常，在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。对于大部分分析工作者来说，一只1cm长的保护柱，那么就应选择2cm或3cm长的保护柱。保护柱越长，自然所装填的色谱填料就越多，则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会。当然，随着保护柱的长度加长，样品的保留时间会比使用短保护柱长。一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。
保护柱的填料装填方式也很重要。目前有薄膜装填法的保护柱，使用过程很简单方便，而且可以在实验室中进行干装。但是，其*大的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料有限，只能提供有限的保护作用；不过也因为所装填的色谱料较少，保护柱的长度也较短，所以对分析样品的保留时间的影响也很小。
另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析拄，设计方式上有直连式、手紧式或整体式。整体式设计是由色谱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候有色谱工作者来安装连接，可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱长度。手上紧即可。另外从保护柱结构又分为是否可以更换保护柱柱芯。可以降低保护柱的使用成本。
大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料，正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料。但是，根据实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料完全相匹配。
对于选择保护柱的原则是：在满足分析分离要求的前提条件下，尽可能的选择较短的保护柱结构，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。