蓝斑核Orexin-A 对肥胖抵抗大鼠自发活动的影响及机制研究

蓝斑核Orexin-A 对肥胖抵抗大鼠自发活动的影响及机制研究

秦 辉 1，2 孙 姝 1 逄明杰 3 郭菲菲 1 孙向荣 1 公衍玲 4 徐 珞 1△

（1 青岛大学医学院病理生理教研室山东青岛266021；2 青州云门山卫生院山东潍坊262500；

3 青岛市立医院  山东青岛 266000；4 青岛科技大学  山东青岛 266042）

摘要目的：探讨蓝斑核（LC）orexin-A 对肥胖抵抗（OR）大鼠自发活动的影响及机制并进一步探究LC 的orexin 调控是否与肥胖抵抗相关。方法：雄性SD 大鼠和选择性培育的OR 大鼠，一侧蓝斑核置管，缓慢均匀注射0.5 μL **（orexin-A 或人工合成脑脊液），用大鼠自发活动检测装置 SPA 箱红外线活动传感器测定测大鼠自发活动（SPA），间接测热法测定其能量消耗，定量磁共振身体组成分析器检测大鼠脂体重和瘦体重。大鼠肥胖程度用体脂百分比表示。结果：与SD 大鼠相比，OR 大鼠的总体重，脂体重和去脂体重显著降低(P<0.05)。OR 大鼠肥胖程度明显小于SD 大鼠(P＜0.05)。OR 大鼠在 3 月龄是主要表现为水平活动，6 月龄时垂直活动增加，故OR 大鼠随年龄增长活动量显著增多(P＜0.05)。OR 大鼠注射orexinA 增加SPA 的作用比SD 大鼠更强，其主要原因是OR 大鼠水平活动时间明显高于垂直活动时间。与SD 大鼠相比，OR 大鼠SPA 水平高、体重轻，日间能量消耗和 SD 大鼠无明显差异，夜间活动消耗更多能量。在 OR 大鼠的 LC 注射 orexin-A 后，两组高剂量 orexin-A 可显著增加 SPA(P＜0.05），并呈现剂量依赖性。对于SD 大鼠，只有*高剂量的OXA 才能引起SPA 显著高于对照组(P＜0.05)。*高剂量的两组orexin-A 注射后，OR 大鼠 SPA 改变比 SD 大鼠更显著(250 pmol: P＜0.05 ；500 pmol: P＜0.05)。 结论：蓝斑核（LC）orexin-A 对肥胖大鼠自发活动有重要影响，其orexin 调控与肥胖抵抗相关。

关键词：Orexin-A；大鼠自发活动检测；蓝斑核；肥胖抵抗性大鼠；能量消耗

中图分类号：R338.2；R-33；R589.2    文献标识码：A 文章编号：1673-6273(2016)06-1018-05

前言

啮齿类动物多个脑区均可表达 orexin-A[1]，其对动物摄食、能量、活动[2]及体重的调节至关重要[3]。Orexin-A具有刺激摄食[4]、调节自发活动（SPA）和能量消耗的作用[5，6]，既可增加能量摄取又可增加能量消耗。研究表明，orexin-A 可通过改变能量消耗和摄食调节SPA，能量消耗比摄食对 SPA 作用更明显。大鼠**注射orexinA 可使体重减轻，体脂比例降低[7]。Orexin-A 缺乏的大鼠进食减少，但由于活动量减少而表现为肥胖[3]。Orex- in-A 对SPA 的作用比对摄食的作用更持久，所需剂量更低[6]。与肥胖大鼠相比，orexin-A 对肥胖抵抗大鼠（OR）的 SPA 促进作用更显著[8,9]。以上数据表明，orexin-A 可调节SPA，与能量平衡相关，对于**神经系统促进SPA 的具体机制还需要进一步研究。

蓝斑核（LC）的神经元接收密集的 orexin 神经纤维[10]，包含两种 orexin 受体，受 orexin 调控[13,15]，其中 orexin-A 可增加 LC神经元的活性[16，17，19]。将 orexin-A 注射到 LC 可增加大鼠 SPA而进食行为无变化[6]。这些数据显示LC 在orexin-A 介导的行为影响方面有重要调节作用。本研究要揭示LC 的orexin-A 调控肥胖抵抗（OR）大鼠自发活动的影响及机制，并探讨其是否 与肥胖抵抗相关。用选择培育的啮齿动物的肥胖抵抗模型（OR  大鼠），其表型特征为低脂饮食[14]。已知SD 大鼠和肥胖大鼠在行为、表型以及对orexin-A 的反应性上相似，故本研究使用SD 大鼠与 OR 大鼠作比较[9，25]。假设 1）与 SD 大鼠相比，OR 大鼠能量消耗更多，SPA 水平更高，在LC 注射 oexin-A 后，SPA 增高，肥胖程度降低；2）各组间注射orexin-A 导致的进食增加量相近。已证实LC 是orexin-A 增强SPA 的重要核团，尚需进一步研究显示LC 是调控高水平SPA 和OR 表型的重要脑区。

1 材料和方法

1.1 实验材料

将雄性SD 大鼠(scxk 鲁20080002)和选择性培育的OR 大鼠各20 只分笼饲养，鼠笼底部为金属丝，含休息平台和咀嚼基板，给予 12 ：12 小时明：暗光循环（06：00 开灯），恒温环境（21-22 ℃），大鼠自由进食和饮水。每种实验大鼠随机分为两组。一组大鼠进行主成分分析（N =10），**组大鼠（N= 10）用于行为研究。Orexin-A；大鼠自发活动实验箱；定量磁共振身体组成分析仪。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝斑核（LC）置管 采用***（50 mg/kg）或甲苯噻嗪（15 mg/kg）腹腔麻醉大鼠。大鼠一侧LC 置入不锈钢套管[9,26]。术后恢复7 天。

1.2.2 Orexin-A 注射 将orexin-A 溶于人工合成脑脊液，**于 4 ℃保存 48 小时。经套管缓慢均匀注射 0.5 μL **[12]。注药完成后，留置注射器 10 s。在 09:00 到 11:00 之间进行注射。将6 月龄大鼠置于开放式八箱间接量热器内，可同时并连续测，注射间隔至少 48 h。若 orexin-A 组大鼠 SPA 超过对照组大鼠SPA 的 56 %[5]，则计入*终数据统计。

1.2.3 SPA 测量  大鼠 SPA 用 SPA 箱红外线活动传感器测定[9]。x 和y 轴的两组红外线阵列用来检测水平面上的移动，第三组位置较高的红外线阵列检测直立活动，即大鼠活动可由三组 红外线实时检测。水平移动（自发活动）和垂直方位（进食或站  立）的活动所需时间通过射线被阻断的数据来估算。自发活动 即水平移动和垂直方位活动的总时间。实验开始前，动物置于SPA箱中适应2 h。

1.2.4 间接测热法测能量消耗 测量每个箱内（内部尺寸长30 cm 宽 26 cm 高 20 cm）的氧耗量和 CO2 产生量，从而计算能量消耗量[11]。在每次检测前，气体传感器要经过标准气体校准。箱内气流保持在 3.1 L / min，实验温度 22 ℃。实验前大鼠置于箱内适应 3 天，整个过程自由进食和饮水。实验开始后，每 30 s 测一次 O  和 CO  体积，24 h 后，每 15 min 进行一次室内空气的标准测定。呼吸交换率定义为24 h 呼吸交换率的平均值。总能量消耗为24 h 热量测量的总和。静息能量消耗是指光照条件下的*低代谢率，并推算24 h 总量。非静息能量消耗是指总能量消耗减去静息能量消耗。

1.2.5脂体重和瘦体重检测用定量磁共振身体组成分析仪（EchoMRI-900)[2]来测定脂体重和瘦体重。大鼠称重后置于圆柱形树脂玻璃箱内。将该玻璃箱放入身体组成成分分析器，检 测需1-2 min。百分比代表体脂和非脂肪组织，可由优良脂肪和非脂肪组织比率以及总体重来分别计算。

1.3 统计学分析  所有数据用均数±标准差（x±s）表示，用GraphPad Prism3.0 软件分析，多组间均数比较采用双因素方差分析，P<0.05 为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 OR 大鼠和SD 大鼠的能量消耗与SPA与SD 大鼠相比，OR 大鼠的总体重，脂体重和去脂体重显著降低(P<0.05，图 1，A-C)。在 3.25 月龄时，OR 大鼠的去脂体重明显低于SD大鼠(P＜0.05) (图1C)。大鼠肥胖程度用体脂百分比表示，5 月龄时，OR 大鼠肥胖程度明显小于 SD 大鼠(P＜0.05，图 1B)。OR 大鼠在 3 月龄是主要表现为水平活动，6月龄时垂直活动增加(图 1，动 D 和E) ，故 OR 大鼠在 6 月龄时比 3 月龄时活动量显著增多(P＜0.05)。与 SD 大鼠相比，OR 大鼠体重轻，24 h SPA 高(图 1，A 和 F)，提示 OR 大鼠虽然体重较轻，瘦体重降低，但其能量消耗要高于SD 大鼠。静息状态下，OR 大鼠消耗能量显著低于非静息状态下的能量消耗(P＜0.05)。 若以 24 h 优良能量来看，OR 大鼠在静息时消耗的能量较少(P＜ 0.05)，而两组大鼠非静息能量消耗的差别无显著统计学意义(P＞0.05)。与 SD 大鼠相比，OR 大鼠SPA水平高、体重轻，日间能量消耗和SD 大鼠无明显差异。以上数据表明，虽然OR 大鼠瘦体重含量低，但夜间活动消耗更多能量。OR 大鼠体重较轻，能量消耗与SD 大鼠相同，说明大鼠身体活动与能量消耗增加有关。

 2.2 蓝斑核（LC）注射OXA 对SPA 的影响  将orexin-A (62.5, 125, 250, 500 pmol/0.5 μL) 或安慰剂注射到蓝斑 [6，9]。注射后，连续测量 SPA 140 min 。由于 orexin-A注射过程也能增加SPA，此效应独立于**作用并可持续20 min，故前 20 min 的结果不计入*终数据统计[12]。在 OR 大鼠的LC 注射 orexin-A 后，SPA 增加。图 2 显示注射三种高剂量orexin-A 后，OR 大鼠活动量明显超过 SD 大鼠  (P＜0.01) ，在LC 注射orexinA 后 1 h，OR 大鼠(P＜0.05)和 SD 大鼠(P＜0.05)的SPA 均显著增加。对于OR大鼠，两种高剂量orexin-A 可显著增加SPA(P＜0.05 两种剂量)，并呈现剂量依赖性。500 pmol剂量的OXA引起的总的活动量显著高于62.5 pmol(P＜0.05)。与之相反，对于SD大鼠，只有*高剂量的OXA才能引起SPA 显著高于对照组(P＜0.05)。在注射后1 h-2 h 间隔期间，两组大鼠间以及不同处理方式间对SPA 的影响无差异(P＞0.05)。注射后 2 h，OR 大鼠对orexin-A 的应答增强（图 2F）。*高剂量的两组orexin-A 注射后，SPA 显著增加，OR 大鼠改变比 SD 大鼠更明显(250 pmol: P＜0.05 ；500 pmol: P＜0.05)。OR大鼠中，250 pmol剂量的orexin-A对SPA 增加的作用显著高于对照组(P＜0.05)，SD 大鼠中，500 pmol 剂量的 orexin-A 相对于对照组显著增加大鼠 SPA (P＜0.05)。 与 SD 大鼠相比，OR 大鼠注射orexin-A 增加SPA的作用更强，其主要原因是OR 大鼠水平活动时间明显高于垂直活动时间(图 2, A 和B)。注射 2 h 后，OR大鼠orexinA 组水平活动显著增加，垂直活动无明显变化。与之相反，SD 大鼠垂直活动增加而水平活动无明显变化。

综上所述，OR 大鼠非静息能量消耗较高，SPA 增加，肥胖倾向减低。LC的特异性orexin信号传导是OR 大鼠和肥胖大鼠行为及肥胖倾向出现差异的主要因素。LC中orexin 信号提高可促进负能量平衡，降低肥胖倾向。目前发现人类肥胖症的 **可将目标转向orexin 系统和行为方向以增加SPA。