1. 以20 uL的qPCR反应体系为例:在一干净的PCR管中,加入下列成分:
反应体系成分
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20 uL体系
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终浓度
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qPCR MagicMix,2×
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10 uL
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1×
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自备引物一a
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x uL
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0.1-0.5 uM
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自备引物二a
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x uL
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0.1-0.5 uM
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自备模板a
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x uL
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自备ROXb
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2 uL
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(可以不加)
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补超纯水到
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20 uL
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放入荧光PCR仪中进行扩增, 并在退火或延长步骤中记录荧光信号。
注意:
a) 通常引物浓度以0.2 μM可得到较好结果,可以终浓度0.1-1.0 μM作为设定范围的参考;通常DNA模板的量以10-100 ng基因组DNA或1-10 ng cDNA为参照,因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同,可对模板进行梯度稀释,以确定*佳的模板使用量。
b) ROX 校正染料:如果使用ABI公司的7500,7700和7900三种型号的荧光PCR仪器,则需用自备的ROX进行Ct值校正。对ABI 7700和7900,ROX的*佳浓度为1×(即在每20 uL 反应体系中加2 uL 10×ROX)。对ABI 7500, ROX的*佳浓度为0.05-0.1×(每20 uL 反应体系加0.1-0.2 uL 10×ROX;也可将10×ROX稀释到1×,然后每个反应体系加入1-2 uL 1×ROX)。ROX会在溶解曲线中产生噪音,因此,如果出现了杂峰,将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾,然后重新分析数据。
对于iCycler IQ,MJ Opticon,MJ Chromo4,MX3000,MX4000, RotorGene3000,RotorGene 6000 和 LightCycler 480等型号的荧光PCR仪器,ROX不是必须的,但加入的话也不会影响整个PCR分析。
2. 循环步骤:根据扩增子的性质和仪器性能,从以下三个过程中任选一个进行扩增。
A:两步快速循环法:适用于引物Tm值设计为60℃的反应
循环步骤
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温度
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时间
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循环数
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酶活化
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95℃
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10 min
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1
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变性
退火&延伸
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95℃
60℃
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15 s
1 min
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35-40
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注意:本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考,发生非特异性反应时,可提高退火温度。
B:三步快速循环法:适用于延伸步骤温度高于退火步骤的PCR(长引物PCR)
循环步骤
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温度
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时间
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循环数
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酶活化
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95℃
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10 min
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1
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变性
退火
延伸
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95℃
56-64℃d
72℃e
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10 s*
30 s
32 s
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35-40
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注意:
a) 退火温度:建议采用两步法PCR,退火温度60℃进行反应。若提高反应特异性,可提高退火温度,以60-64℃作为设定范围的参考。若因使用Tm值较低的引物等原 因,得不到良好的实验结果时,可尝试进行三步法PCR扩增,三步法的退火温度请以56℃-64℃的范围作为设定参考。延伸温度:延伸温度设为72℃通常可以提高扩增效率。但是,对于AT含量大于70%的扩增子来说,延伸温度设为60℃为宜。
C:通用循环法:这种循环方法适用于几乎所有的荧光PCR仪,也适用于用快速循环法不能扩增的模版。
循环步骤
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温度
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时间
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循环数
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酶活化
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95℃
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10 min
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1
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变性
退火&延伸
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95℃
60℃
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15 s
60 s
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35-40
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3. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合DNA时,*大吸收光谱在471nm,结合DNA时的*大吸收光谱在500nm,*大发射光谱在530nm。
其他注意事项:
1. 如果使用iCycler,可以不加入FAM。
2. 如果使用Roche LightCycler的玻璃毛细管进行PCR,需加入终浓度为0.5mg/mL的自备BSA。
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