间接竞争ELSIA如何提高灵敏度？

间接竞争ELSIA如何提高灵敏度？

我正在一个小分子ELSIA试剂盒，因为这类盒子的灵敏度要求高，检测下限，要0.05ppb,我现在做到250ppt，IC50是5ppb，前面就做不了抑制了。我尝试以下方法

一、降低包被原，抗体浓度增加，提高空间有限

二、增加抗体稀释倍数，抗原浓度增加，

以上两个方法效果不理想，还是达不到要求，

三，我搭配一下，标准品和抗体使用量。有点效果，但是不明显

这样一个问题。是包被原合成的问题吗？小分子和蛋白的耦联是不是应该小一些，这样会好点。

原来经典的ELISA方阵实验，是通过抗原抗体各自稀释成不同浓度，然后选取OD值在1.0左右的那个Ag-Ab浓度为*佳工作浓度，再做以后的抑制曲线。那么到底为什么选择OD值1.0呢？大部分原因是酶标仪在1.0-1.5左右读数较灵敏，便于分析。

但是，对于抗原抗体而言，由于它们被稀释成不同浓度，那么在理论上，每个抗原稀释度情况下，总有一个抗体的稀释度其OD值在1.0左右，那么到底选取哪一个OD值1.0左右的好呢？这就需要同时用**做个抑制来看，哪个浓度下抑制情况好，就取哪个抗原抗体浓度做工作浓度。从我个人的经验来看，包被抗原稀释度越大，抑制情况会好些。因为包被抗原是包被在板上为固相的，抗原稀释度大，其浓度也越低一些，即使抗体过量了，但它是游离的，也会随洗板过程而洗掉，那么在抗原量一定，**在低浓度下做间接竞争ELISA，就可以明显看出抑制来。这就是经典的抗原抗体的*佳结合浓度了。做小分子单抗的，要的就是抗体的灵敏度和特异性，如果灵敏度和特异性不好，检测限不高，那做了也没什么意思。在抗体拿到手的情况下，首先测定抗原抗体*佳结合浓度，才是后面做这个抗体各个特性分析的关键。

所以，对于你的情况，我还是那句话, 你所用的抗原抗体浓度到底是如何确定的?如果只是做了间接ELISA,OD值1.0左右确定的,结果并不能说明问题.只有把抑制一起做了，挑一个抑制好的浓度才能进行分析。如果你挑选了一个抑制的好的做下来还是这样，那估计就是抗体不好了。你说你做的多抗，多抗的成分非常复杂，做的好的话还好，做的不好的话交叉反应会大，而且特异性不好。还有你用的是重氮法偶联的，重氮法合成结构中没有桥结构，连接的**小分子很有可能被包埋在蛋白内，造成**动物后不识别半抗原表位或识别较少，从而降低抗体特异性。建议换种方法合成，比较一下看哪种合成法产生的**效果好，再做抗体，要不会事倍功半。

重新做个方阵,每个浓度同时做抑制,然后选取OD值在1.0左右的,抑制*好的一个抗原抗体浓度来作为工作浓度,这样的浓度应该为抗原抗体*佳工作浓度.在这个浓度下再做曲线,灵敏度应该会好一些.

此外,也可以把**和抗体在37度下预先孵育20-30分钟,也会提高灵敏度.

还有你说的包被原问题,既然是试剂盒,只要你放的时间不长,应该问题不大的.我自己合成的包被原一年了还可以用,我合成的**与蛋白偶联比为44:1,效果很不错.

1、“国外厂家实验后发现要达到5000ng左右甚至10000才有明显的抑制作用。”这个就说明一抗的灵敏度不够，一般单克隆抗体半数抑制在100纳克以内，好的单抗可以达到十几或者几纳克，这样检测限可以达到纳克级或是皮克级。你的一抗是买的吧？如果是买的，先问清楚他们一抗的灵敏度、特异性如何，半数抑制怎么样，然后再买。听你说的，**要用到5ppm-10ppm才有明显抑制，那这个抗体应该是不咋地。

2、你所说的是间接竞争ELISA中，抗体的稀释浓度与工作浓度的问题。如果你做方阵确定好了抗原抗体浓度，如你所说例如抗原250ng，抗体1：1200，那你在做间接竞争ELISA稀释抗体时应该先稀释成1：600，然后与**倍比稀释加入到孔里面，这样抗体的*终反应浓度就为1：1200了 。

做ELISA分析，*重要的是有个好的抗体，如果抗体不行，那你做那么多工作就有些浪费时间了。建议你换厂家购买，或是问问现在的厂家，单抗在卖给你之前或运输途中是否经过反复冻融？你使用时有无反复冻融？一般抗体买回来都是分装成小管（如5-10微升一管），用一次就仍掉了。尽量减少冻融的次数。