ATP荧光检测技术介绍（3）-ATP荧光检测仪技术文章
1. 常见的ATP分析方法。
根据ATP与其所含杂质理化性质的差异，发展起来很多分析方法，归纳起来主要有层析法、电泳法和光学分析法。光学分析法中ATP试剂盒法和生物发光法能够选择性检出ATP，不必对ATP进行分离。层析法和电泳法则为先分离后检出。后二者能同时提供更详细的杂质的信息。
一．层析法
当各组分的分配系数及亲和力存在一定差异时，可以通过层析法将其一一分离。ATP的层析分析方法主要有纸层析法、薄层层析法、离子交换柱层析法和高效液相色谱法。
1. 纸层析法
纸层析方法测定ATP含量是生化试剂核苷酸含量测定的通用方法，其常用的展开剂组成为异丙醇+浓氨水+ 水（7:1:2）。对于一些定性分析，也可以直接用显色剂显色观察结果。
2. 薄层层析法
薄层层析法与纸层析法一样，是生化试剂核苷酸含量测定的通用方法。该方法通常以正丁醇+ 丙酮+冰乙酸+5%氨水+ 水（7:5:3:3:2）为展开剂，点样量20ug,，在以硅胶GF为吸附剂的薄板上展层。层析完毕后，于50℃干燥，紫外光下观察吸收斑点。
3. 离子交换柱层析法
核苷酸是两性化合物，不同的核苷酸的电离常数（pK）和由此得到的等电点存在差异。当介质的pK值不同时，其所带的净电荷也会不同。pK值高于5时，所有的核苷酸都会带负电荷，会被阴离子树脂吸附，因此可以采用分步降低pK值或分步增加阴离子浓度的方法将不同的核苷酸依次洗脱下来。检测洗脱液A260，将之与洗脱液体积作图，便能得到ATP的分析结果.
这也是目前工业生产和一些实验室中制备ATP的方法.
4. 高效液相色谱法
ATP与其主要杂质AMP和ADP的*大紫外吸收峰位于相同的波长处，且摩尔吸光系数相同。刘克江等人利用该原理采用UV-HPLC法检测了ATP片剂，得到了良好的结果。
二．电泳法
核苷酸分子上既带有碱性基团，又带有酸性基团。在一定条件下，通过荷电核苷酸分子特性的差异，可以用电泳法将不同的核苷酸分离开来。依据支持介质及技术上的差异来划分，见诸报道的ATP电泳分析方法主要有纸电泳法、醋酸纤维薄膜电泳法、琼脂糖凝胶电泳法和毛细管电泳法。
1. 纸电泳法
该方法采用纸电泳将ATP与杂质分离，紫外分光光度计测定分离出的ATP的吸收值，计算其含量。
2. 醋酸纤维薄膜电泳法
早期的醋酸纤维薄膜电泳法采用了与纸电泳类似的实验路线，仍然要通过电泳、干燥、描斑点、洗脱、测吸光度值等步骤来测定ATP的含量，程序繁杂。为避免这种情况，张若燕在测定了市售ATP注射液中ATP的含量时，直接采用薄层扫描仪进行扫描测定，解决了ATP分离后还需洗脱的麻烦，获得了与部颁标准法一致的结果。
3. 琼脂糖凝胶电泳法
为了简单快速地测定ATP含量，邱蔚然等人设计了琼脂糖凝胶电泳法：在特种平板玻璃上，以琼脂糖做支持介质，以0.05mol/L、pH3.5 的柠檬酸溶液做缓冲溶液，在40V/cm电压梯度下电泳5min,实现了ATP与其它杂质的有效分离，测得了ATP含量.
4. 毛细管电泳法
采用毛细管的区带电泳技术（CZE），克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散问题，使分析灵敏度有了很大提高，分离效率可达到百万块塔板数。而将电泳原理和色谱法相结合的毛细管胶束电动色谱（CMEC），还解决了电泳法不能分离中性物质的缺陷。
在建立电泳分析方法中，改进或寻找更好的电泳支持介质，将有助于提高ATP, 分析的分辨率；采用适当的分离方法与检测方法搭配将有利于减少工作步骤，提高分析数据的准确性。
三．光学分析法
腺苷酸的腺嘌呤碱基上存在共扼的双键，因此AMP、ADP、ATP在紫外区均有吸收峰，且其*大吸收峰位于相同的波长处，因此可以用紫外分光光度法检测其含量。此外它们在酸性条件下与二乙醛水合三聚体反应，可产生稳定的强烈荧光，核酸的其它碱基及鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶等对此反应不发生干扰，藉此可以建立荧光分析法选择性测定混合物中的腺嘌呤及其衍生物。但由于无法区分不同的腺苷酸，在ATP分析中，它们往往被作为*终的检测方法与ATP, 的分离方法配合使用。特别地，通过与一些试剂的选择性反应，ATP可以被单独检出，新发展起来的ATP试剂盒法和生物发光法在这方面显示了独特的优越性。
1. ATP试剂盒法
磷酸甘油激酶催化ATP 和3-磷酸甘油酯之间的反应时，伴随有还原型NADH生成氧化型NAD，此过程溶液的吸光度在340nm处有变化，此吸光度变化与ATP浓度有相应的线性关系。据此美国的SIGMA公司生产了ATP试剂盒，使用它可以将ATP选择性定量检出。
2. 生物发光法
生物发光法是Mcelroy等首先引入的。此方法所依据的原理是：在荧光素酶和Mg2+的作用下，荧光素与ATP发生腺苷酰化被活化，活化后的荧光素与荧光素酶相结合，形成荧光素-AMP复合体，放出焦磷酸(PPi)。该复合体被分子氧氧化，导致荧光素产生电激发，放出CO2和H2O，当荧光素从激发态回到基态时发射光。*后L-AMP脱离酶，形成荧光素L和AMP。反应所产生的光和AMP含量成正比，根据发光的强弱就可以选择性定量测定AMP的含量。
生物发光法作为一种简便、快速的微生物检验方法和食品生产环境洁净度的检测方法，近年来在国内外倍受注目，并得以广泛应用。日本东亚电波工业公司研制的ATP测定仪AF-100可以在40s内完成测定。目前，日本应用生物发光法原理生产微生物检测用器材的厂家已有6家。
表1 各类ATP分析法比较
| 方法 | 原理 | 优点 | 缺点 |
| 纸层析法 | 层析分离后检测 | 技术成熟，操作简便 | 操作时间长，精度低 |
| 薄层层析法 | 层析分离后检测 | 技术成熟，操作简便 | 精度低 |
| 离子交换柱层析法 | 层析分离后检测 | 可大量制取ATP | 操作时间长，精度低 |
| 高效液相色谱法 | 色谱分离后检测 | 操作简便，结果准确 | 仪器昂贵 |
| 纸电泳法 | 层析分离后检测 | 技术成熟 | 操作繁琐，耗时长 |
| 醋酸纤维薄膜电泳法 | 层析分离后检测 | 电泳时间短，检测便捷 | 需要薄层扫描仪 |
| 琼脂糖凝胶电泳法 | 电泳分离后检测 | 电泳时间短 | 精度低 |
| 毛细管电泳法 | 色谱分离后检测 | 快速、便捷、精度高 | 仪器昂贵 |
| ATP试剂盒法 | 选择性检出 | 操作简单，精度高 | 未分析杂质 |
| 生物发光法 | 选择性检出 | 操作简单，结果准确 | 未分析杂质 |
3. ATP荧光检测法的原理
ATP即三磷酸腺苷，是高能磷酸化合物，它是由一份子腺嘌呤，一分子核糖和三个相邻的磷酸集团构成的核苷酸。
ATP存在于所有有机体中，为活细胞提供能量
ATP生物发光技术的原理是荧光素酶（Luciferase）以荧光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2为底物，在Mg2＋存在时，能将化学能转化为光能。ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源。
Luciferin +ATP+O2 Oxy-Luciferin+AMP+PPi+H2O+hv
在一定的ATP浓度范围内，此反应所释放出的光强度与体系中存在的ATP数量成良好的线性关系。因为三磷酸腺苷(ATP)存在于所有的活体细胞中，并且各生长期的**都还含有较恒定的ATP 量，因此这可以作为一种活体细胞的指示剂，通过ATP生物发光法检测出ATP数量，并由此推算出体系中**的数量。与传统的平板培养法相比，这种方法能快速得到结果，并且操作者无需技术，方法简便易懂，更容易被普通人群接受，而平板培养法所需时间较长，通常需要培养24-48 h，才能得到*终结果，并且对操作者的技术要求较高，操作复杂。但ATP生物发光法有其局限性，由于不同种类**所含的ATP量不同，并且同一种类**，ATP含量也随**的细胞大小，健康状况、生长阶段和生长环境不同而不同[1]，因此ATP生物发光法检测**无法反应**种类，也无法**显示**数量。但生物发光法无需培养过程，操作简便、灵敏度高，数分钟内即可得到结果，具有其他微生物检测方法无法比拟的优势，是目前检测微生物*快的方法。
ATP生物发光技术主要包括以下几个步骤：擦拭物体表面取样，菌体细胞与ATP提取剂作用提取出ATP，ATP与荧光素酶-荧光素体系反应，用特定检测仪测定发光值，通过发光值得到ATP量并推算出**数量。现在市场上已出现各种基于ATP生物发光技术用于快速检测微生物的产品，但是这些自成体系的检测系统，通过其检测仪所得到的相对发光值不具有可比性，除非通过ATP标准曲线将相对发光值转化成ATP量，才可进行比较。
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