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动物行为学实验方法指南

 
动物行为学实验方法指南
高级篇
整体行为学实验室建设案例
本案例由安徽正华生物仪器设备有限公司“动物行为学实验站高级培训基地”提供
一、动物行为学实验室建设原则
近年来,随着动物行为学日趋向综合化、整体化的方向发展,若要在国际上发表有高影响力的研究论文,单一的行为学研究已经不能满足需要。一个经得起实践检验的行为学研究成果,必然需要从动物的多个行为角度去阐述。因此建立一个多功能的整体行为学实验室已经越来越重要。我们下面以第四军医大学解剖教研室“行为学实验高级培训基地”为例,介绍一下整体行为学实验室的建设要点。
1、            确定研究方向
根据第四军医大学解剖教研室的研究方向、场地以及经费情况,确定需要研究的动物行为包括学习记忆(高级神经功能)、焦虑、抑郁及精神依赖。
2、            确定实验模型
学习记忆(高级神经功能):采用经典的Morris水迷宫用于研究空间记忆,穿梭、避暗用于研究条件反射记忆
焦虑:采用经典的高架十字迷宫,并辅以避暗、旷场实验
抑郁:采用强迫游泳与悬尾实验
精神依赖:采用条件性位置偏爱(CPP
在进行动物行为实验前,均应对动物的运动能力进行筛选,因此需配置自发活动
3、实验室规划
因为许多实验不需要同时进行,考虑充分合理的利用空间,采用3个相对独立的实验室旋转上述仪器,并且采用大小鼠通用的设计,穿梭箱与避暗箱可共用一个隔音箱
4、实验室建设
实验建设遵循以下几个方面的原则
(1)    原则参考普通环境标准,该环境设施符合动物居住的基本要求,不能完全控制传染因子,适用于饲养教学等用途的普通实验动物。
(2)    动物行为学实验设备一般体积较大、数量较多,实验室空间根据实验设备的要求定制和设计实验场地,学习记忆功能实验室要求**房高2.5米,推荐2.8米。
(3)    给水排水系统:上水水压0.3~0.5Mpa,冷热水分别独立提供;实验室下水口距地面高度低于10cm
(4)    实验室内光照度:室内光照度恒定,阻断室外光线(隔光窗帘或无窗户),室内光源由室内烟提供,分为实验光源和工作光源,实验光源根据不同实验设备专门布置射灯位置及角度,实验时保持实验光源提供的光照度恒定不变(可以用光照计测量);工作光源漫反射光源,照度为150~300LX.
(5)    动物房光线:动物房内要有较亮的工作光线和较暗的生活光线调节;要装有昼夜明暗交替照明系统,每12h轮转照明,工作照度150~300LX,动物照度15~20LX,调节实验动物节律跟人类一致。
(6)    通风:实验动物一般对气味非常敏感,对实验室、动物房要有独立的通风系统,换气次数8~10/h,气流速度0.1~0.2m/s(较好是从笼子里出来直接排到室外,而不是排到室内)。
(7)    隔音:实验室建设初期可在四同墙壁中加装隔音层或者后期加装波峰海绵,室内噪音低于60dB(也可购置专门的隔音箱)。
(8)    温度:室内温度恒定19~26℃为宜(日温差小于4℃),推荐20~25℃(日温差小于3℃),冷热双制空调系统是必需的。
(9)    动物房距离实验室的距离因在同一隔离区域内,实验动物繁育、生产、实验设施应与生活区保持大于50m的距离,尽量避免实验动物的搬运过程接触外界。
10)实验过程中禁止实验人员或其他人员在实验室内或实验室门外频繁进出,避免在同一间实验室内同时进行两项或两项以上的实验,去除实验人员对实验动物的影响。
11)相对湿度控制在40%~70%较好。
12)实验室的电脑操作室要求独立一个房间,避免影响实验。
13)每套电脑应单独控制一套设备为宜。
14)实验室较好配置恒定白噪音发生器(避免外界和动物间的声音干扰)
15)实验室的电气指标要求三厢,可拼配接20A电流。实验室因配置UPS设备,保证实验室供电稳定性保证实验正常进行。
16)走廊带度不应少于1.5m,门宽度不少于1.0m,房高不能低于2.8m
17)所有实验室应配置照明光源和工作光源,实验时不要使用实验室照明光源,水迷宫实验室工作光源均匀分散在实验室边缘(推荐使用4个台灯,置于实验室4个角落,亮度为白炽灯60w左右,节能灯13w左右);实验室窗户上推荐使用黑色窗帘耳光。
18)强迫游泳实验台应该是上下两层,每层实验台都应该有旋转下水管的洞口,下面安装下水地漏,方便排水;推荐在墙壁上预留上下两排水龙头水管接口,方便实验时加水
19)电脑**配置:cpu主频1.7G以上,内存512M以上,硬盘8G以上,操作系统windows XP,带DVD刻录机。
5、动物行为学实验室摆放范例图
 
经典动物行为学实验设计范例
在第一篇中,我们针对动物行为学的基本原理、常用动物、常见实验模型方法及实验设备等进行了介绍,但值得注意的是:行为学研究是当今生物医学界最为热闹的研究领域之一,这方面的发展日新月异,新的方法与手段层出不穷,在进阶篇中我们还将介绍一些实验方法,如震惊反射、自身给药、滚轮等。在实际的研究工作中,针对不同的研究方向我们应合理的选择实验方法,下表是常用的研究方向可供选择的实验方法。在高级脑功能研究中,不同的模型所反映的脑功能是不同的,选择的时候应特别注意。
动物行为学实验方法应用领域
实验方法
研究方向
自发活动(旷场实验)
镇静药、抗(致)焦虑药,学习记忆,运动能力,生物节律
Morris水迷宫
学习记忆
穿梭箱
学习记忆,认知神经科学、神经生理学、神经药理学、神经退行性疾病
八臂迷宫
学习记忆
Y迷宫
学习记忆
跳台实验
学习记忆
避暗箱
抗(致)焦虑药,学习记忆
高架十字迷宫
抗(致)焦虑药,焦虑行为机制
悬尾实验
抗(致)抑郁药
强迫游泳
抗(致)抑郁药
学习无助
抗(致)抑郁药
震惊反射
抗(致)焦虑药
Zero迷宫(0)迷宫
抗(致)焦虑药,焦虑行为机制
自身给药
药物依赖,药物成瘾,动物心理
条件性位置偏爱
药物依赖,药物成瘾,动物心理
本篇我们先通过2个具体案例详细介绍动物行为学观察手段的结合利用。在范例一中会以Morris水迷宫为例,详细介绍动物行为学实验从设计到操作的整个流程以及在实验过程中需要密切关注的小的细节,细节虽小,但足以决定实验的最终成败,因为所有行为学实验的研究结果必须有可重复性。这些动物行为学实验的细节具有普适性,通用于其他的行为学观察。在范例二中概要介绍行为学方法的综合利用,并不再过多涉及行为学实验的细节。
 
实例一:慢性束缚应激对大鼠空间学习记忆能力的影响【12
人类和动物在日常生活中经常处于应激的作用之下,大部分应激虽不会造成躯体的实质性损伤,但却影响个体的高级脑功能,其中的指标之一就是个体的学习记忆能力。神经科学领域中常常利用应激模型动物来观察应激的后果以及可能的干预措施的作用,束缚大鼠即是常用的物理应激模型。为了评估束缚应激对高级脑功能的影响的后果,本实验利用Morris水迷宫实验评估大鼠的空间学习记忆能力。
只有动物的空间记忆能力完整,大鼠才能顺利完成水迷宫任务,空间记忆能力与海马密切相关,同时海马是最易被应激反应累及的中枢结构之一。因此,应激刺激可以通过影响海马,进而改变大鼠的空间学习记忆能力,其外在的表现就是大鼠完成水迷宫任务的能力发生改变。
水迷宫与八臂迷宫相比具有明显的优点:水迷宫实验不需要提前对大鼠进行食物或者饮水剥夺,大鼠在水迷宫实验中完成实验的动力强劲------不顾一切逃离水池。另外,每一次的训练结果都是有效的,大鼠会努力完成每次水迷宫任务,因此不会因放弃任务而最终出现无效训练。
在大鼠水迷宫实验中,每个实验组通常应包括810只动物,才能获得的足够进行统计学分析(例如变异性分析,ANOVA)的实验数据。在我们的实验中,每组包括12只大鼠。
材料
大鼠:在设计实验前,需要注意某些种属的大鼠或小鼠由于本身的遗传背景,往往不能完成水迷宫实验,应该注意种属选择,本实验选用成年雄性SD大鼠。
束缚器:采用自制束缚器,保证大鼠不能在束缚器内回旋但能呼吸。
水迷宫:淮北正华生物仪器设备有限公司研制的商业水迷宫。
视频捕捉系统:淮北正华生物仪器设备有限公司开发的鼠博士动物行为学分析系统。
硬件设备
搭建迷宫:水迷宫的硬件可以自行制作,但必须满足以下要求:
a.       外在参照物(external cues):水迷宫周围要有不同的参数,供大鼠参考并建立寻台策略:例如实验室的门、天花板上的灯、以及悬挂在四壁设计简单的图案,需要注意的是实验室内所有大鼠能够看到的外参在实验过程中都要保证位置固定。
b.      水池和站台:原则是水池不能太小,站台也不能太大,水池太小或站台太大都会增加大鼠随机上台的几率,出现假阳性结果。目前大鼠水迷宫的直径大多为1.61.8m,本实验采用淮北正华生物食仪器设备有限公司研制的大鼠水迷宫,直径1.6m,水迷宫内壁为黑色,水迷宫高55cm。深色圆形站台直径10cm,表面粗燥(方便大鼠上台时抓持),站台高度可调。在水迷宫参照学习实验中,站台露出水面1.5~2cm;在定位航行实验中站台表面隐藏于水面下1.5~2cm;空间探索实验时撤除站台。
c.       水深和水温:用墨法染黑池水,水深23cm。水温对潜伏期影响很大:如果温度过高,大鼠游几次后渐渐适应迷宫环境,就把迷宫当成“浴盆”,在泳池中漂浮不动;如果温度过低,大鼠体温下降很快,体力也会耗散太多,游泳能力不能坚持很久,就会出现游几次潜伏期突然增大的现象。本实验利用恒温装置保持水迷宫水温在25度上下。
d.      光源:要保证水迷宫水面上没有光影,主要是避免光线在水面的反射,以免留在水面的光照影子被软件的采集系统混淆为大鼠的影子,影响最终自动分析大鼠中心点。在我们的装置中,采用地面反射的间接弱光系统,保证了动物光影和周围环境图像信号的高信噪比,从而实现精确的图像分析。
e.       实验者:在开始实验前,实验者应与受试动物建立良好的感情,让动物熟悉实验者的身体信息,如气味、相貌等。捕捉动物的动作要温柔,忌讳手抓鼠尾,以免过分刺激动物。鼠的嗅觉很敏感的,在实验过程中应当避免使用较强气味的化妆品或香水。另外,如果大鼠能够看到实验者,水迷宫实验过程中,实验者或者躲藏或者保持固定位置,避免造成大鼠能够看到的人体移动。
 
实验日程安排
a.       实验前适应期:实验前使大鼠适应实验者和实验环境一周:-6d?1d
b.      慢性束缚应激:
设定(1)束缚应激组(CRS):每天830AM开始束缚大鼠6h,连续14dn=12
2)对照组:每天830AM开始将大鼠剥夺食物饮水,保留在饲养笼内6h,连续14dn=12
c. 水迷宫实验:第15天首先将站台升出水面2cm,进行参照学习实验。随后将站台降入水面下2cm,开始定位航行实验,定位航行实验持续5天(15d?19d)。未尾一次训练后24h撤除站台,进行空间探索实验。
慢性应激对大鼠空间学习记忆能力影响的实验安排:实验大鼠适应实验环境7天。慢性束缚(CRS)组每天8:30AM起接受6h束缚,持续14d。对照( Control)组大鼠每天相同时间在鼠笼内禁食水。第15d起按照水迷宫实验具体操作依次进行参照学习、定位航行和空间探索实验(参见下文)。
 
水迷宫实验具体操作
a.       水迷宫参照学习实验(cued learning test):大鼠在水迷宫训练中能否顺利找到站台除受到空间学习记忆能力的影响外,还受到自身的游泳能力、视觉状态的影响。因为我们实验的目的是检测大鼠空间学习记忆能力的可能改变,所以要排除游泳能力、视觉状态的影响,为实现这个目标,在水迷宫定位航行实验前,需要进行参照学习实验。
. 将站台升至水面上2cm
. 随机选择除目标象限之外的其余3个象限之一,将大鼠面向池壁轻柔放入水中。
. 每次实验大鼠游泳60s来寻找站台:如果成功地找到站台,大鼠可以在站台上休息10~30s;如果未能成功的找到站台,就由实验人员将鼠轻柔引导到站台上,同样休息10~30s。确保每只大鼠有相等的时间来观察和获取空间信息。
. 将大鼠取出放置于干燥箱内休息5min,再次重复Ⅱ?Ⅲ步骤,每只大鼠每天训练4次。
. 通过动物行为分析系统记录大鼠游泳视频并用于离线分析,大鼠在4次训练中的上台潜伏期平均值用于比较游泳能力和视觉功能的差异,游泳能力和视觉功能没有明显差异的大鼠被用于后续的定位航行和空间探索实验。
 
慢性束缚应激后大鼠的游泳能力、视觉功能没有发生改变
慢性束缚应激大鼠(CRS)和对照大鼠(Cont)在参照学习实验中上台潜伏期(a)、上台前游泳路程(b)和游泳速度(c)不存在统计学差异。
b.      定位航行实验(Navigation Test):本实验每天进行4次,持续5d,使大鼠通过不断重复的空间学习过程,最终缩短其上台潜伏期。
. 将站台降至水面下2cm
. 随机选择除目标象限之外的其余3个象限之一,将大鼠面向池壁轻柔放入水中。
. 每次实验大鼠游泳60s来寻找站台:如果成功地找到站台,大鼠可以在站台上休息10~30s;如果未能成功的找到站台,就由实验人员将鼠轻柔引导到站台上,同样休息10~30s。确保每只大鼠有相等的时间来观察和获取空间信息。
. 将大鼠取出放置于干燥箱内休息5min,再次重复Ⅱ?Ⅲ步骤,每只大鼠每天训练4次。
. 通过动物行为分析系统记录大鼠游泳视频并用于离线分析,测量指标包括上台潜伏期、上台前路程、游泳速度、寻台策略等。
c. 空间探索试验(Probe test):定位航行实验结束后24小时,撤除站台,让大鼠在水迷宫中游泳30s,测定其空间记忆能力。
. 撤除站台。
. 随机选择除目标象限之外的其余3个象限之一,将大鼠面向池壁轻柔放入水中。
. 让大鼠游泳30s
. 取出大鼠,空间探索实验的次数不宜过多,一般1~2次,我们的实验中只进行一次空间探索实验。
. 通过动物行为分析系统记录大鼠游泳视频并用于离线分析,测量指标包括靶象限活动时间百分比、穿越站台区域次数、游泳速度等。
 
水迷宫关键参数
a.       单次定位航行训练时间:根据水迷宫大小,训练时间一般为60s90s,也有用120s的。大鼠在60~120s之间能够找到隐藏站台的次数差异大约只占其功能次数的5%,这样统计学上是“小概率事件”。也就是说,大鼠在60s内找不到隐藏站台的话,再延长到120s也很难找到。而且60s还可以减小各组的标准差,可以节约实验时间。但问题并非如此简单,定位航行实验上台潜伏期应采用重复测量,在统计时,很多研究将**潜伏期直接纳入统计,显然,较大潜伏期的不同将不可避免地影响统计结果。所以从统计学上了解不同的**潜伏期到底对Morris不迷宫实验结果有多大的影响,如何避免因此带来的系统误差等问题尚有待进一步研究。根据经验,如果水迷宫直径超过2m,可以设置单次训练时间为120s,直径大于2m,选择训练时间为60s
b.      实验次数:在定位航行实验中,每天训练4次,随机选择人水象限,尽量避免将大鼠连续放入同一个象限,因为大刀产可能会凭借位置或其他非记忆信息(如向右转弯)来定位站台。在空间探索实验中,将大鼠置于水池中追踪的时间从30s120s,测量次数一般为1~2次。有时候需要重复空间探索实验,因为在有些情况下,首次实验会观察到一些非正常变量,可能一些动物在改变了实验条件后迷失了方向。连续进行的两次实验计算平均值可以减少偏差,可以提供一个较高的精度和对先前学习记忆的较好控制。但是如果实验次数多于两闪,将会导致在目的象限活动时间减少,得到不准确的空间探索结果。
慢性束缚应激显著损害大鼠的空间学习和记忆能力
 
 
 
 
 
 
 
在定位航行实验中,慢性束缚应激大鼠(CRS)的上台前游泳路程(a)、上台潜伏期(b)显著长于对照大鼠( Cont),游泳速度(c)不存在统计学差异。在空间探索实验中,慢性束缚应激大鼠(CRS)在靶象限游泳时间百分比显著低于对照组,穿越站台次数也显著少于对照组。★★p<0.01,p<0.05,vs Cont。
 
实例二:创伤后应激障碍模型大鼠的自发活动和焦虑水平检测【13
创伤后应激障碍(post traumatic stress disorder ,PTSD),是指突发性、威胁性或灾难性生活事件导致个体延迟出现和长期持续存在的精神障碍。主要表现为反复重现创伤性体验(闯入症状)、持续警觉性增高、刺激相关情景回避等。在大鼠动物模型中,PTSD的核心表现包括(1)条件性恐惧反应:对应激源相关场景产生明显的条件性恐惧反应,主要模拟闯入性症状;(2)敏化的恐惧反应:与创伤无关的普通刺激,如果强度达到一定程度,能够引起放大的行为和生理反应,称之为“敏化”现象,模拟PTSD的警觉性增高症状。同时,PTSD动物模型还可能会出现焦虑水平改变等行为学表现。
利用单次延长应激结合足底电击(复合应激,SPS&S),14d后,大鼠出现明显PTSD核心症状,第15d我们利用旷场实验观察大鼠的自发活动能力;高架十字迷宫观察大鼠的焦虑水平。
材料
大鼠:本实验采用成年雄性SD大鼠,每组12~17只大鼠不等。
强迫游泳:安徽正华生物仪器设备有限公司研制的大鼠强迫游泳器。
足底电击器:安徽北正华生物仪器设备有限公司研制的穿梭箱部分改造。
乙醚
旷场:安徽正华生物仪器设备有限公司研制的4大鼠旷场实验设备。
高架十字迷宫:安徽正华生物仪器设备有限公司研制的1大鼠高架十字迷宫。
视频分析软件:安徽正华生物仪器设备有限公司开发的动物行为学实验站系统。
实验日程安排
a.       适应期:实验前使大鼠适应实验室一周。
b.      PTSD建模:大鼠适应实验室环境后,顺次给予复合应激:束缚2h----强迫游泳20min----乙醚麻醉至意识丧失------恢复后给予不可逃避足底电击。这些处理动物属于复合应激组(SPS&S),假处理组(Shan)大鼠分别暴露于处理场所而不接受上述应激处理。
c.       药物处理期: SPS&S组以及Sham组接受药物干预(PRX):通过饮水给予抗应激药物帕罗西汀(20mg/kg/d),除此之外不打扰动物;空白处理(Veb)大鼠接受饮用水。药物及空白处理共持续14d
d.      行为学观察:第15d首先进行旷场实验(OF)随后进行高架十字迷宫(EPM)检测。
PTSD模型大鼠自发活动及焦虑水平检测的实验安排:实验大鼠适应实验环境7d。实验组(SPS&S)组大鼠接受复合应激处理(参见下文);假处理组(Sham)只暴露于实验场所而不接受复合应激。之后两组大鼠分别通过饮用水接受药物帕罗西汀(PRX)或空白对照(Veh)共计14d。第15d进行旷场OFEPM检测。
SPS&S复合应激建模具体操作
a.       束缚处理:实验日830AM开始用自制束缚器束缚大鼠2h
b.      强迫游泳:束缚结束后,立即进行强迫游泳,大鼠强迫游泳桶为透明塑料,桶高50cm,内装2/3高度的纯水,水温24度,将大鼠置入桶内强迫游泳20min,随后取出烘干恢复15min
c.       乙醚麻醉:随即以乙醚麻醉大鼠直至意识丧失,取出大鼠放于电击箱内恢复30min
d.      足底不可逃避电击,电击箱内,在196sec的适应期后,给予大鼠单次持续时间为4sec,电流强度为1mA的不可逃避足底电击。
旷场实验具体操作
a.       旷场:旷场大小为47 ×47cm(H),置于弱光照明隔音实验室内,上方安置红外线摄像头,通过与之相连的电脑记录实验录像。
b.      放置大鼠:将大鼠轻柔置入旷场中央,随后启动记录系统,记录大鼠在15min内的活动资料。
c.       清洁实验区域:一只大鼠实验结束,更换下一只大鼠前,用70%酒精仔细清除实验区域内大鼠粪便、尿液,彻底去除遗留气味,随后开始下一轮实验。
d.      数据分析:利用鼠博士动物行为分析系统,采集大鼠在旷场内的水平活动距离、垂直活动距离、中心区域活动时间等指标。
 
帕罗西汀干预并不影响大鼠的自发活动
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
单次或持续(14d)帕罗西汀(PRX)处理并不影响假处理(Sham)大鼠在旷场内的水平活动距离。复合应激(SPS&S)并不导致大鼠在旷场内水平活动距离的明显改变,单次或持续(14d)帕罗西汀(PRX)处理并不影响复合应激组(SPS&S大鼠在旷场内的水平活动距离。
 
高架十字迷宫实验具体操作
a.       高架十字迷宫:大鼠高架十字迷宫离地50cm,开放臂和闭合臂尺寸为50cm (D)×10cm(W)。两个闭合臂分别围以40cm高的挡板,中央区大小为10cm (W)×10cm(D)。设备置于弱光照明隔音实验室内,上方安置红外线摄像头,通过与之相连的电脑记录实验录像。
b.      放置大鼠:将大鼠面向一侧开放臂,轻柔置入高架十字迷宫中央区域,随后启动记录系统,记录大鼠在5min内的活动资料。
c.       清洁实验区域:一只大鼠实验结束,更换下一只大鼠前,用70%酒精仔细清除实验区域内大鼠粪便、尿液,彻底去除遗留气味,随后开始下一轮实验。
d.      数据分析:利用鼠博士动物行为分析系统,采集大鼠在高架十字迷宫开放、闭合臂内的活动距离、活动时间、进入次数等指标,从而计算开臂停留时间百分比、开臂运动距离百分比、开臂进入次数百分比等指标。
持续帕罗西汀干预降低复合应激组大鼠的焦虑水平
复合应激组合大鼠开臂进入次数百分比(a)和开臂停留时间百分比(b)显著低于假处理组(P0.05vs Sham)。给予单次帕罗西汀处理反转SPS&S组大鼠降低的开臂进入次数百分比(a),但并不改变开臂停留时间百分比(b)。持续帕罗西汀干预则反转SPS&S大鼠降低的开臂进入次数百分比(a)和开臂停留时间百分比(b)。p<0.05, #p<0.05,vs SPS&S+Veh。