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粗多糖含量测定中标准品的选择 -混匀仪技术文章
粗多糖含量测定中标准品的选择 -混匀仪技术文章
粗多糖含量测定中标准品的选择 -混匀仪技术文章
多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物(一般10个以上)。多糖是一切有生命的有机体必不可少的成分,它与维持生命的种种生理机能有着密切的联系。用于粗多糖含量测定的方法有很多,一类是利用了多糖的还原性,测定还原性多糖的方法有3, 5-二硝基水杨酸盐(DNS)比色法和Somogyi-Nelson法。另一类测定方法,也是现在普遍使用的方法,是利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物,然后再与酚类或胺类化合物缩合,生成有特殊颜色的物质的这一性质进行测定,这类方法有地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。
苯酚-硫酸法是用得较多的方法,苯酚-硫酸试剂可与游离的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应,己糖在490 nm处有*大吸收值,吸收值与糖含量呈线性关系。此法是先用标准糖制作标准曲线后,再通过多糖的显色反应测定吸光度,然后根据其在曲线上的位置推算出多糖的浓度从而推算其含量。此法操作简单、快速、灵敏、重复性好,对每种糖仅需制作一条标准曲线。蒽酮-硫酸法是另一种常用的方法,其原理是利用糖类遇浓硫酸脱水后生成糖醛或其衍生物,可与蒽酮试剂缩合,反应后溶液呈蓝绿色,于620 nm处有*大吸收,显色深度与多糖的含量呈线性关系。
目前,在制作标准曲线的标准品的选用上普遍存在争议。葡萄糖因为其低廉的价格和方便的来源,一直是研究人员的优选。但当我们深究比色法的原理,发现其本身不能区分单糖和寡糖,所以它的测定结果很大程度上依赖于标准品的选择。此外,比色法通常用浓硫酸短时间水解粗多糖,对于分子量较小的粗多糖,高浓度的硫酸可以在较短时间内将其水解成寡糖和单糖,但当粗多糖的分子量较大时,水解是很难控制的。比如对香菇粗多糖(分子量500,000~1,000,000)的完全水解就需要4M HCl或2M H2SO4于100℃作用3-6小时。因此如果用葡萄糖做标准曲线,势必对粗多糖样品中大分子部分的测量带来很大的误差。所以,国内外的学者的研究数据表明:1)对于比色法测定当标准品与被测样品的结构类似时,得到的结果要准确得多[1];2)用葡萄糖做标准品和用葡聚糖做标准品测粗多糖含量时,前者测的结果不同程度的偏高[2, 3]。这样看来,用葡萄糖作为测定多糖含量的标准品是不合适的。
认识到这一事实,人们开始逐渐改用葡聚糖作为测定粗多糖含量的标准品,*为广泛使用的是分子量为500,000的葡聚糖(经中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所验证)。百特纯大分子科技有限公司(Putus Macromolecular Sci.& Tech..Ltd)是主要从事碳水化合物大分子领域的新品研发及应用的国际公司,制造并提供高质量、高纯度、高均一性的具有特定分子量和支化度的碳水化合物大分子标准品及其相关产品。我公司采用β-葡聚糖含量*高的燕麦作为原料,提取的燕麦葡聚糖是一种β-(1, 3)和β-(1, 4)糖苷键连接而成的线性多糖,我们使用先进的工艺和技术对粗多糖进行分级,得到分散度极窄(1.01-1.05)的,分子量范围从10, 000到1, 800, 000的单分子量燕麦β-葡聚糖标准品,不含淀粉、蛋白质等杂质,水溶性好,稳定性高。更宽泛的分子量,更窄的分散度,更有竞争力的价格,这无疑缓解了目前国内在粗多糖含量测定中多糖标准品一品难求的局面,为获得更准确的实验结果和更稳定的实验数据提供了有力保证。
苯酚-硫酸法是一种常用的检测粗多糖含量的方法,其原理是苯酚-硫酸试剂可与游离的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应,在480-490 nm处有*大吸收值,吸收值与糖含量呈线性关系。此法是先用标准品多糖制作标准曲线后,再通过多糖的显色反应测定吸光度,然后根据其在曲线上的位置推算出多糖的浓度从而推算其含量。此法操作简单、快速、灵敏、重复性好,对每种多糖仅需制作一条标准曲线[1]。
目前大家研究较多的、生物活性较高的一些**多糖,如香菇多糖、灵芝多糖、姬松茸多糖、猴头菇多糖、灰树花多糖等[2],在结构上大多是以β-(1→3)、β-(1→4)或β-(1→6)糖苷键连接的葡聚糖,另外,分子量也一般分布在十几万到几十万之间。因此,由北京卫生防疫站建立,经中国预防科学院营养与食品卫生研究所验证的《粗多糖含量的测定方法》中建议使用50万分子量的葡聚糖作为标准品[3]。为行业内粗多糖含量的测定统一了标准,使各企业之间多糖类产品更具有可比性。
燕麦β-葡聚糖是一种β-(1→3)-(1→4)键接的线性葡聚糖,在结构、粘度等其他物理性质上与常见的植物和**多糖很相似,适合作为植物、**来源多糖含量测定的标准品。但由于多糖纯化困难,市面上不少葡聚糖纯度较低,不适合作为标准品。下面,我们来比较两种不同纯度的燕麦β-葡聚糖产品作为多糖标准品的区别。
1 材料与方法
1.1 实验材料
高纯度燕麦β-葡聚糖PS-Con-Ⅰ由武汉百特纯大分子科技有限公司提供,纯度大于97%(其中,另外3%主要是结合水),低纯度燕麦β-葡聚糖由某食品研究所提供,纯度约50%,苯酚、浓硫酸均为化学纯。
1.2 实验方法
样品溶解:高纯度燕麦β-葡聚糖经70℃水浴,15min后完全溶解。低纯度燕麦β-葡聚糖70℃水浴,30min后仍有不溶物,升高溶解温度至90℃后继续溶解30min,仍有少量不溶物,过滤。
溶液配制:配制0.1mg/ml葡聚糖标准溶液,50mg/ml苯酚溶液备用。
标准曲线的制作:精密吸取葡聚糖标准液0.10,0.40, 0.80,1.20,1.60,2.00ml(分别相当于葡聚糖0.01,0.04,0.08,0.12,0.16,0.20mg),补充水至2.0mL,加入苯酚溶液1.0ml,混匀,再加入浓硫酸5ml,混匀,沸水浴2分钟,混匀,冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比,测定吸光度值(A),以A为横坐标,葡聚糖含量C为纵坐标绘制标准曲线。
2 结果与分析
2.1 样品溶解
高纯度燕麦β-葡聚糖溶解速度较快,溶液澄清透明,说明此产品溶解性良好。低纯度燕麦β-葡聚糖难以溶解,且溶解1h后仍有不溶物存在,说明此产品溶解性差,杂质较多。
高纯度
低纯度
2.2 标准曲线
下表为两种标准品分别配制不同葡聚糖浓度(含量)反应后得到的吸光值:
葡聚糖含量(mg)
0.01
0.04
0.08
0.12
0.16
2.00
高纯度标样吸光值
0.053
0.080
0.200
0.262
0.353
0.450
低纯度标样吸光值
0.001
0.055
0.113
0.173
0.240
0.320
通过数据处理,得到标准曲线如下:
高纯度燕麦β-葡聚糖 C=0.4657A-0.0068 (R=0.9955)
低纯度燕麦β-葡聚糖 C=0.609A+0.0101(R=0.9985)
比较这两个标准曲线发现,当待测样品吸光值一定,使用低纯度葡聚糖作为标准品得到的标准曲线计算葡聚糖含量值时,明显高于高纯度标准品。
究其原因,低纯度葡聚糖所含杂质较多,在作为标准品时,部分杂质不能溶解,却计入了标准品葡聚糖总量,因此,使得结果偏高。另外,即使溶解的物质中,也有可能存在部分不能参加反应的蛋白等杂质,同样会造成结果偏高。
由以上数据和分析可以得出,测定粗多糖含量不能使用低纯度葡聚糖作为标准品,应尽量选用高纯度葡聚糖标准品,按照国家建议方法和行业标准进行检测,这样才能保证各企业多糖系列产品在含量和纯度上的可比性,有利于规范企业行为和保健品市场。
转自生命科学论坛
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