无菌检查方法——薄膜过滤法

无菌检查方法——薄膜过滤法

根据2020年版《中华人民共和国药典》的规定，当供试品的性质允许时，包括能直接过滤或者经过处理后能过滤的供试品，应采用薄膜过滤法进行无菌检查。薄膜过滤法能有效去除**中的**成分，而**及其他微生物则会留在过滤器上。通过对残留微生物的培养，促进其生长与繁殖，定性或定量检测微生物 。

薄膜过滤法

试验方法

薄膜过滤法一般采用封闭式薄膜过滤器，根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，对水溶性液体供试品、水溶性固体和半固体供试品、非水溶性供试品、可溶于十四烷酸异丙醇的膏剂和黏性油剂供试品、无菌气雾剂供试品、装有**的注射器供试品、具有导管的医疗器械（输血、输液袋等）供试品等多种特性试样进行无菌检查。

无菌检查需要满足的检测环境要求

无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。日常检验需对试验环境进行监测。通常采用的检测环境有以下两种：

1. B级洁净度背景下，局部单向流A级洁净度空气区域的检测环境；

2. 一般区/CNC/D级洁净度背景下，采用经验证合格的A级洁净度单向流无菌隔离系统的检测环境。

单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。

薄膜过滤法常见问题汇总

01

供试品溶解不彻底

在进行固体注射剂（例如密封瓶粉针剂）的无菌检查时，需先将其溶解、转移并适当稀释，随后通过薄膜过滤法进行过滤处理。在进行溶液与稀释时，溶剂及稀释液的选择、配比以及振荡器的应用等因素，均会对供试品的溶解效率与过滤效果产生直接影响。

根据2020年版《中国药典》四部无菌检查法的规定，推荐的稀释液包括0.1%无菌蛋白胨水溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以及0.9%无菌氯化钠溶液。实验研究显示，采用前两种稀释液时，微生物的回收率显著高于使用0.9%无菌氯化钠溶液。若供试品未能充分溶解，过滤时滤膜将会吸附大量供试品颗粒，即便经过多次冲洗，这些被吸附的供试品仍难以完全**，残留在滤膜上的供试品会导致阳性菌不能在规定的条件下生长。

02

集菌培养器选择不当

为了避免操作过程中的人为污染和偏差，多数实验室倾向于采用一次性全封闭集菌培养器对供试品溶液进行过滤。在选择全封闭集菌培养器时，滤膜的材质、孔径及其与供试品的相容性成为影响试验结果的关键要素。为确保微生物能被有效截留而不受供试品或其溶剂的干扰，特别是考虑到某些注射剂具有抑菌性并易于被滤膜吸附，应选用具有疏水性边缘和低吸附特性的滤膜，例如尼龙膜材质的集菌器。无菌检查中使用的薄膜过滤器滤膜孔径应不超过0.45微米，此孔径能有效捕获微生物。同时，每片滤膜的总过滤量需控制在合理范围内，以防微生物受损。

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市场上一次性全封闭集菌培养器的品牌、型号及规格繁多，适用于不同类型的产品。例如，安瓿瓶装药液，可选用配备加长型取样针的集菌培养器，无需额外转移样品，即可快速完成检品的转移；西林瓶装粉剂则可选择双针座设计的集菌培养器，提供全封闭溶解方案，实现溶解、过滤、冲洗的一体化操作，避免转移步骤；对于需稀释的西林瓶装抑菌性粉剂，三针座设计的集菌培养器更为合适，它集成了溶解、稀释、过滤、冲洗的全过程，有助于降低抑菌成分浓度，减少吸附。

检验人员在挑选集菌培养器时，需综合考虑产品的溶解度、抑菌程度等因素，以确保达到预期的过滤效果。不当的选择可能导致冲洗液用量增加，进而影响检验结果的可靠性。

03

冲洗方法不具体

某些注射剂具有较强的抑菌作用，因此，在供试液过滤后，还需通过冲洗液进行冲洗，以消除其抑菌效果。然而，一些无菌方法验证报告中的试验操作步骤描述得过于简略，仅仅列出了冲洗量和冲洗次数，却未详细记录冲洗量的确定过程，也未注明冲洗时的流速。事实上，冲洗流速对实验结果具有重要影响：流速过慢可能无法彻底冲洗掉抑菌成分，从而无法有效消除供试品的抑菌作用；而流速过快则可能损伤微生物，导致检验结果无法真实反映供试品的无菌状态。因此，在进行无菌检查时，应详细记录冲洗量的确定过程，并严格控制冲洗流速，以确保实验结果的准确性和可靠性。

04

培养基储存不当

适用性检查合格的培养基，若储存不当，会导致其质量下降，甚至变得不合格，进而影响无菌试验结果的准确性。以无菌检查中常用的硫乙醇酸盐流体培养基为例，该培养基能在普通有氧环境中提供厌氧条件，支持需氧菌和***的良好生长，且便于观察试验结果。根据2020年版《中华人民共和国药典》四部规定，在供试品接种前，培养基的氧化层高度应不超过培养基深度的1/3，培养结束后则不应超过1/2。这一要求旨在确保培养基的厌氧层能满足***的生长条件。

培养基氧化层的高度受储存条件的影响。不同实验室根据培养基的使用量，会采取不同的储存方式。对于使用量较大的实验室，可能会选择大批量配制后，采用无菌灌装并在容器内填充氮气、压盖，然后在2～25℃的温度范围内储存。而使用量较小的实验室，则可能采用硅胶塞及纱布包裹瓶口**后，在2～8℃的温度下避光保存。无论采取何种储存方式，都需要进行相关的验证，以确定*佳的保存条件，从而确保培养基的质量始终符合要求。

05

酶的活性降低

在***类注射剂的无菌检查中，针对抑菌作用较强的β-内酰胺类***，除了应用薄膜过滤法外，还可结合使用中和剂β-内酰胺酶，以更有效地消除供试品的抑菌活性。具体操作时，在供试品经过过滤和冲洗后，向集菌器中的培养基内加入β-内酰胺酶，以此中和那些即便经过冲洗仍少量吸附于滤膜上、未能完全去除的供试品活性。β-内酰胺酶的使用不仅能减少冲洗液的总量和冲洗次数，还能防止滤膜上的微生物受损。

值得注意的是，β-内酰胺酶的储存条件对其活力至关重要，通常应在2～8℃下保存。储存温度的变化会直接影响酶的活性，因此，实验室在使用此类酶时，必须严格遵循产品说明进行储存，密切关注储存温度和时长对酶活性的影响。若储存不当导致酶活性降低，而仍按标示酶活性计算加入量，则可能无法彻底消除供试品的**作用，从而影响无菌检查的准确性。

06

阳性对照菌未按要求加入规定量

2020年版《中国药典》明确要求，根据供试品的特性来选定阳性对照菌。在制备阳性对照实验的菌液时，其方法与方法适用性实验相同，且规定的加菌量不得超过100 cfu。然而，部分厂家为了节省成本，检验人员会采用新鲜液体培养基制备菌液，并在初次检测菌液含菌量符合标准后，便将其储存于4℃冰箱中供后续多次使用。在这些后续的使用过程中，检验人员并未每次都重新检测所加入菌液的具体含量，而是直接按照**使用时的量来添加。这种做法可能导致实际加入的阳性对照菌量远超规定值，甚至达到规定量的几倍。尽管在这些条件下阳性菌能够良好生长，使得实验表面上看似成立，但实际上却掩盖了实验可能存在的问题，导致了实验结果的误导性。