产品名称：大肠杆菌O157:H7酶联**反应测试盒

大肠杆菌酶联**反应测试盒 1．概述 　　大肠杆菌O157:H7酶联**检测试剂盒是用来检测食品和饲料中大肠杆菌O157:H7的含量。大肠杆菌O157:H7是肠杆菌家族的一种革兰氏阴性菌，“O”指的是菌体抗原，“H”指的是鞭毛抗原，这是大肠杆菌数以百计血清型中的一种。大多数片段是无害的，通常存在在哺乳动物的肠中。这个O157:H7片段能产生志贺祥**，是肠出血性大肠杆菌（EHEC）级的一个成员，会导致严重的**，感染上肠出血性大肠杆菌的人会出现肠出血症和溶血性尿毒综合症。污染致病原主要存在于：生的细纹牛肉、未经巴氏**的牛奶、未经处理的水、果汁、嫩芽、生菜和腊肠中。 　　检测食品中大肠杆菌O157:H7既费力又费时。REAGEN™大肠杆菌O157:H7酶联**检测试剂盒为国家管理部门、食品生产商、质检部门提供了方便有效的方法，检测水平为105细胞/ml。 2．试剂盒原理 　　该试剂盒基于酶联**检测原理，大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体包被在微孔内。分析过程中，如果样品中有大肠杆菌存在，当加入样品时，即可与单抗结合，在孔中加入适当的培养液可以快速增菌。酶标记的二抗与板孔中包被的一抗结合，加入底物后颜色的深浅与样品中大肠杆菌O157:H7的含量相关。 3. 试剂盒组成 试剂盒组成 规格 保存 抗体包被的酶标板 12×8 孔 2-8°C 1×阴性对照 1×1ml -20°C 1×阳性对照 1×1ml -20°C 50×HRP- 二抗 3×50l -20°C 二抗稀释液( 1×20ml 2-8°C 20×浓缩洗液 1×30mL 2-8°C 终止液 1×20mL 2-8°C TMB底物 1×10mL 2-8°C 4. 检测限：105细胞/ml 5. 交叉反应： 　　　本试剂盒可检测大肠杆菌O157:H7抗原 　　　 6．其他需要而本试剂盒未提的设备或材料 酶标仪（450nm） 恒温培养箱 漩涡振荡器 移液器(10、20和100L，1mL各一支) 多道移液枪：50-300l（可选择） mTSB培养基：含有10g/L酪蛋白氨基酸和1.5g/L磷酸氢二钾的胰化酪蛋白大豆培养基 7.注意事项 实验前请阅读以下文字，以保证获得*佳实验效果。 样品中含有大肠杆菌，请小心使用。 进行样品准备过程中，操作人员必须有好的微生物操作技能。 不要使用过期的试剂盒。 不同批次的试剂盒不要混用，确保二抗正确稀释。 尽量保持室温20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫纸巾或其他物料。 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。 8．肉样品的制备 25g肉样品均质2分钟并在225mL mTSB培养基中120rpm 37℃下培养过夜， 取出1mL培养基， 121℃高温**或者煮沸20分钟。使样品冷却回复到室温，混匀后可以用大肠杆菌O157:H7试剂盒进行检测。 9．酶联**反应测试步骤 试剂的准备 　　所有的试剂在使用之前应将其回温至室温，并在使用试剂前摇动几下，以保证合理的浓度。准备所需足够量的试剂，不要将配置的试剂倒回原试剂瓶中，在操作试剂时建议一次性使用降低污染程度。 （1）1×HRP-二抗工作液 　　按1：49的比例配置50×HRP-二抗和二抗稀释液 （2）1×工作洗液 　　按1：19的比例配置20×浓缩洗液和蒸馏水 检测步骤 　　以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。 试剂 每个反应需要的体积 1×阴性对照 50L 1×阳性对照 50L 1×HRP-二抗 50L 1×洗液 2.0ml 终止液 100L 底物 100L 取出需要的板孔，分别加入50l的阴性对照、阳性对照于所设定的孔中 加入50l 样品于所设定孔中 室温25℃下避光孵育30分钟 每孔加入1×洗液300l 洗板3次，*后一次洗板后倒置**板中多余水分，可用吸水纸吸干（不允许在洗板后，下一步操作前将板孔风干） 每孔加入50l 1×酶标二抗，25℃下避光孵育30分钟 每孔加入1×洗液300l洗板3次，*后一次洗板后倒置**板中多余水分 每孔加入100l TMB底物，轻轻振荡混匀，25℃室温下避光孵育15分钟。 每孔加入100l终止液终止反应。 在加入终止液后尽可能快的用450nm酶标仪读取板孔读数 10．结果分析 （1）视觉判定结果 加入终止液前需视觉判定 　　阳性对照：蓝色 　　阴性对照：无色或浅蓝色（接近无色） 如出现下述现象样品中就含有大肠杆菌 　　1）阴性对照为无色或淡蓝色，阳性样品颜色明显深于阴性对照 　　2）阳性样品颜色一般明显深于阴性对照，但是不必一定和阳性对照颜色相同 如出现下述现象样品即为阴性 　　1）阴性对照为无色或淡蓝色 　　2）样品的颜色和阴性对照颜色相同或非常接近 （2）OD值判定 酶标仪450nm处读取样品吸光值 　　阴性对照：450nm下读数小于0.4，否则说明洗板不彻底 　　阳性对照：450nm下读数大于1.0 如果两个对照没有满足以上条件，实验需重做 　　阴性样品：OD（450nm）＜0.6 　　阳性样品：OD（450nm）≥0.6 注意：样品的判定需要在对照符合标准的条件下方可进行 　　　用试剂盒检测出的可疑阳性样品若想进一步确认，建议如下： 取没被加热的阳性样品培养基接种到含5溴基-4氯基-3吲哚基-b-D葡萄糖苷酸山梨酸琼脂（Mac Conkey’s sorbitol agar）上再次进行培养，然后再接种到碱性亚甲蓝琼脂上。确认的大肠杆菌O157:H7可以通过凝集实验与O157抗体结合而被鉴定出。