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即用型PCR试剂盒3.0使用说明书

即用型PCR试剂盒3.0使用说明书

Instant PCR Kit 3.0

产品及特点

本产品是在本公司即用型PCR试剂盒2.0的基础上改良而来,内含Taq DNA聚合酶dNTPsMgCl2反应缓冲液PCR增强剂上样染料等所有PCR所需要的成分, 用户只需加入模板和引物即可进行PCR反应, 具有广泛的用途。

1. 扩增效率和灵敏度更高。

2. 方便,用户只需准备模板和引物既可以进行PCR实验。

3. 快捷,操作步骤已经*大限度地简化,能减少污染,降低实验误差。

4. 本产品A型含电泳染料,PCR反应液可直接上样电泳进一步简化了操作。

5. 产物可直接用于T载体克隆,不需要额外的加A反应。

6. 染料单独提供,方便客户组合

规格及成分

成 份

编 号

100次包装

600次包装

PCR MagicMix 3.0

90805

1.5 mL

9 mL

专用染料

 

60 uL

360 uL

使用手册

90805sc

1份

1份

注:本产品分A和B两种

A型产品:PCR MagicMix 3.0中直接加入了专用染料;

B型产品:PCR MagicMix 3.0中没有加入专用染料,染料单独提供

运输及保存

低温运输,-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂

DNA模板、引物、超纯水

使用方法

 以30 uL的标准PCR反应体系为例在一干净的PCR管中加入下列成分

PCR MagicMix 3.0

15 uL

DNA模板(自备)

 

哺乳动物基因组DNA

0.5-1 ug

酵母基因组DNA

5-500 ng

**基因组DNA

0.5-50 ng

质粒DNA

5-500 pg

PCR回收片段

1-100 pg

PCR引物(自备)

10 pmol each

补水

30 uL

放入PCR仪中进行PCR, 结束后取5-10 uL直接上样电泳(A型产品不需要额外再加DNA上样液), 红色染料电泳速度相当于50 bp DNA片段。B型产品用户按照1.5 mL PCR MagicMix 3.0加入60 uL专用染料的比例将60 uL专用染料加入到1.5 mL PCR MagicMix 3.0中。

 

注意:

1.如果反应体系不是30 uL各成分需要按比例增加或减少

2.如果DNA模板中有PCR不明抑制物(植物、土壤和血液等DNA样品常含此类抑制物),可以在PCR体系中加入1/10的PCR抑制物**剂(CAT#:60804,30uL体系中加3uL),可能会对PCR有帮助。

相关资料

PCR反应的影响因素

变性温度与时间:模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。变性温度太高,又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃ 20~30秒,高温时间应尽量缩短,以保持耐热DNA聚合酶的活力,*高变性温度不宜超过95℃。

退火温度与时间:退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45~68℃之间。设置特定反应的*适退火温度,可根据引物的(G+C)%含量进行推测,一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃,退火时间一般为30~60秒,足以使引物与模板之间完全结合,长时间退火没有必要。

延伸温度与时间:PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定,如同样扩增2 Kb片段,若使用Taq酶只需1分钟,使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现,时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。

循环次数:可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素,设定20-40个循环。循环次数太少,扩增量不足,如果循环次数太多,错配几率会增加,非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。

酶量:50 μL反应体系可用0.5-5 U酶,酶量的选择与模板DNA的量,扩增片段大小等有关,酶量过多易发生非特异性反应,而且可能增加突变的机率,尤其在进行高保真扩增时,应尽量减少酶量,但酶量过少时反应性能下降。

模板:模板可以是单链DNA,也可以是双链DNA,质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多,不超过1 μg为宜,因为加量过多可能导致非特异性扩增增加,但是要考虑模板中靶序列的含量。例如,使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列,就需要适当加大模板用量。

引物:引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸,*高不宜超过30个核苷酸,*佳长度为20~24个核苷酸,如需插入酶切位点,应在酶切位点5端多加几个碱基,有利于酶切。引物的(G+C)%含量组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中(G+C)%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构,如发夹结构。两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3端。如果可能,引物3端*好富有GC,这样退火后有利于引物3端的延伸。人工合成的引物*好经过色谱层析纯化或PAGE纯化,以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2 μM左右,浓度太高会导致非特异性扩增,太低则扩增产物太少。

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