血管内皮细胞不仅参与调节血管通透性和凝血过程,在**调节,移植排斥,肿瘤转移,炎症等许多过程中也具有重要作用。内皮细胞培养是体外研究内皮细胞功能的重要手段。人脐带静脉是人血管内皮细胞*易获取的来源,在人内皮细胞的研究中被普遍采用。
㈠原理
在体外,内皮细胞在内皮细胞生长因子存在的条件下可迅速增殖,并可传代,可作为内皮细胞增殖,细胞因子分泌、表型等研究的模型。
㈡方法
1. 脐带内皮细胞的分离
试剂与器材
⑴胶原酶(Sigma):I 型((C-0130),用无血清RPMI 1640 配成0.1%(W/V),分装、-20℃保存。
⑵Cord Buffor:
NaCl0.14M 8.182 克
KCl 0.004M0.298 克
glucose 0.01M 2.180 克
NaHPO4.12H2O0.030 克
0.001M
Na2HPO4·12H2O 0.290 克
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加三蒸水至1000ml
配好后8 磅、20min 高压**
⑶脐带静脉插管:取16 号针头去掉尾部及头部斜面,用砂纸磨平,全部套入输液用硅胶管,硅胶管
另一端再接另一个16 号针头。
⑷止血钳4 把、30ml、10ml 注射器,无菌手套、粗丝线、饭盒等。
操作步骤:
⑴脐带收集:用无菌止血钳夹闭脐带两端,在止血钳外侧剪断脐带,放入盛有4℃Cord Buffer
的饭盒内。脐带在4℃放置不应超过24 小时。
⑵脐带内皮细胞分离
带无菌手套,取出脐带,在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球**后,
用无菌剪刀将两端脐带剪除。
↓
在脐带一端找到静脉,插入脐带静脉插管,用2根粗丝线扎牢,
用Cord Buffer 抽吸有的30ml 注射器冲洗静脉腔,至将脐血洗净。
↓
赶出静脉腔内残余液体,将脐带另一端用止血钳夹闭,用10ml注射器
连接针头,注入37℃预热的0.1%胶原酶约6-8ml,放入37℃
Cord Buffer 中保温6-10min
↓
吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液,加入预加有20mlcord
Buffer 的离心管中,冲洗静脉腔,一并加入离心管中。
↓
离心,1500rpm,10min
弃上清,用5~7ml 20%FCS,RPMT 1640 重悬细胞,转入培养瓶,
放5%CO孵箱
2. 牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物的制备
试剂和器材:
生埋盐水,硫酸链霉素,组织匀浆机,高速冷冻离心机,振荡器等。
操作步骤:
取新鲜牛下丘脑,加1.5 倍体积的冰生理盐水
用组织匀浆机匀浆,每次0.5min,共6 次
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在4℃条件下用震荡器机械震荡约1.5h。
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离心,10000g,40min,收取上清液,
↓
按0.5%加硫酸链霉素,4℃过夜
↓
离心,20000g,40min,收取上清液,
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用紫外分光光度测280nm,260nm OD 值按公式计算蛋白含量
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过滤、分装、-20℃保存备用
3. 内皮细胞的培养与鉴定
试剂与器材
⑴0.1%胰酶0.02%EDTA-Na:称取胰酶及EDTA-Na,用无血清RPMI1640 配成溶液,
胰酶浓度为1%,EDTA-Na浓度为0.2%。过滤,分装,-20℃保存。用前用无血清RPMI1640 稀
释10 倍。
⑵0.2%明胶:称取明胶,用三蒸水配成0.2%(W/V)溶液,37℃水浴溶解,过滤,放4℃备用。
⑶199 培养基(按说明配制),小牛血清。内皮细胞生长因子粗提物,肝素,第Ⅷ因子抗体,培养瓶,
CO孵箱,倒置显微镜,超净工作台等。
操作步骤:
⑴培养瓶包被明胶:培养瓶(25cm)中加入0.2%明胶3ml,使其铺满瓶底,放4℃备用。用前
弃去明胶溶液。
⑵原代培养:将从脐带静脉中收集到的内皮细胞移入包被明胶的培养瓶(25cm),加5~7ml 20
%小牛血清199 培养基,牪"按终浓度分别为20μg/ml 和100μg/ml 加入内皮细胞生长因子粗提物
和肝素。每3~4 天换液1 次。
⑶传代培养:待内皮细胞生长铺满瓶底后即可传代。吸去培养基,用无血清RPMI1640 2ml 洗培
养瓶1 次。加入0.1%胰酶、0.02%EDTA-Na3ml,放37℃孵箱。待镜下见大多数细胞卷缩变圆,
可加入含血清培养基3ml,以终止胰酶的消化作用,用弯头滴管吹打。收取细胞悬液,加入离心管中,离心
1500rpm,10min。弃上清,以完全培养基重悬细胞,移入培养瓶扩大培养。
⑷内皮细胞鉴定:光镜下内皮细胞为多角形或梭形,可见1~2 个清晰的细胞核。透射电镜下,部分内皮细胞中可有特征性的Weible-Palade 小体存在。间接**荧光染色,内皮细胞为ⅧR∶Ag 阳性。
⑷牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物活性的测定
试剂与器材:96 孔板。余同内皮细胞培养。
操作步骤:
0.1%胰酶0.02%EDTA 消化收获内皮细胞,计数,调整细胞
数至5×104/ml,
↓
细胞悬液加入包被明胶的96孔板,每孔100μl,5×103个细胞。
↓
放置于5%CO孵箱,24h,待细胞全部贴壁生长
↓
每孔加待检样品100μl,每个稀释度设3 个复孔,并设
培养基阴性对照
↓
放5%CO孵育,48~72h,待阴性对照与阳性有
明显差别时,加3HTdR,每孔0.5μci/50μl
↓
放5%CO孵箱,继续培养12h
↓
细胞收集仪收集细胞,检测Cpm值可计算刺激指数
㈢注意事项:
1. 严格无菌操作,防止在分离、培养和传代内皮细胞过程中发生污染。
2. 胶原酶消化时所需浓度,时向要进行预试。如胶原酶浓度过高,内皮细胞容易死亡;浓度过低,
则细胞收获量低。
3. 内皮细胞应进行鉴定,以防将成纤维细胞误认为内皮细胞。
1. 标本采集在无菌条件下于健康产妇分娩后立即取新生儿脐带,挤出脐带血管中的血液放入装有含青链霉素的PBS液瓶中,2h 之内行脐静脉内皮细胞培养。
双抗:青霉素100u/ml; 链霉素100μl/ml
PBS:KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L,Na2HPO4
内皮细胞培养
1.取产后的新鲜脐带。如不立即培养可以保存于4℃中,但不宜超过12 小时。无菌剪取长10~15 厘
米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管,亦可用于培养。
2.先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的静脉中,洗除残血,注入口处宜用线绳结扎,以防液体返流。
3.用血管钳夹紧脐带一端,从另端向脐静脉中徐徐注入*终浓度为0.1%的胶原酶,待末端出现液体后
结扎之,令充满血管,注入口亦应结扎,以防液体返流,消化3~10 分钟。
4.吸出含有内皮细胞的消化液,注入离心管中,为获取更多细胞,可再注入温PBS 冲洗2~3 次彻底清
除干净残余细胞,一并注入离心管中离心。
5.吸除上清,加1640 培养液,制成细胞悬液,接种入瓶皿中培养,顺利时2~3 天内细胞即可长成单层。