高品质96T 人糖化血红蛋白A1c(GHbA1c)ELISA试剂盒 人糖化血红蛋白A1c(GHbA1c)ELISA试剂盒

人糖化血红蛋白A1c(GHbA1c)酶联**分析试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用

检测范围：15.6 μg/ml -1000 μg/ml
*低检测限：3.9 μg/ml
特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人GHbA1c，且与其他相关蛋白无交叉反应。
有效期：6个月
预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中GHbA1c含量。
说明
1．试剂盒保存：-20℃(较长时间不用时)；2-8℃(频繁使用时)。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
概述
糖化血红蛋白A1c(glyocosylatedHbA1，HbA1c)是自身血红蛋白通过非酶促糖化反应形成的产物。**红细胞内的血红蛋白主要是HbA1c，糖化血红蛋白是血红蛋白在高血糖的作用下发生缓慢连续的非酶促糖化反应的产物，其主要形式为HbA1c，此外尚有HbA1a1、HbA1a2及HbA1b三种。HbA1c的形成过程先由血红蛋白β链N末端缬氨酸的氨基与巳糖(主要为葡萄糖)的醛基发生加成反应形成中间产物醛亚胺，称为前HbA1c。此反应迅速且可逆，故又称不稳定型HbA1c；继而通过Amadori转位，分子重排形成酮胺，其速度缓慢但不可逆，称为稳定型HbA1c。β链N末端缬氨酸的糖基化并未影响与2，3二磷酸甘油酸的结合，但改变了其复合的立体构象及正电荷的表面分布。正常生理条件下，非酶促糖化反应产物的生成量与反应物的浓度呈正比。由于蛋白质浓度保持相对稳定，糖化水平主要决定于葡萄糖浓度，也与蛋白质与葡萄糖接触的时间长短有关。由于葡萄糖可自由透过红细胞膜，血红蛋白的半衰期为60天，故HbA1c的测定可反映测定前6-10周内的平均血糖水平。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗GHbA1c抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗GHbA1c抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的GHbA1c呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板(Assay plate )：一块(96孔)。
2. 标准品(Standard)：2瓶(冻干品)。
3. 样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。
4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶。
5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶。
6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody)：1×120μl/瓶(1：100)
7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin)：1×120μl/瓶(1：100)
8. 底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 干净的试管和Eppendof管
5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，*好用多通道移液器
6. 蒸馏水，容量瓶等
标本的采集及保存
1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响*后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。*后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1000 μg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释1000 μg/ml，500 μg/ml，250 μg/ml，125 μg/ml，62.5 μg/ml，31.2 μg/ml，15.6 μg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 μg/ml，临用前15分钟内配制。
如配制500 μg/ml标准品：取0.5ml(不要少于0.5ml)1000 μg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
生物素标记抗体的稀释原则：
临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：
临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37℃,60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
注：
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是*后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间*好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，*好做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请*后乘以稀释倍数。
6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。