一、流式细胞仪的检测范围

　　1.流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。

　　2.流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、**结合位点和细胞受体。 www.labdd.com

　　二、流式细胞仪的临床应用

　　1.流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡;

　　2.流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和**瘤细胞、活化血小板、造血干细胞(CD34+)计数、白血病与**瘤的**分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和**状态监测;

　　3.流式细胞术在**学中的应用：可以进行**细胞及其亚群分析、**细胞**分型、检测细胞因子。

　　三、流式细胞仪的科研应用

　　主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。

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　　四、流式细胞术常规检测时的样品制备

　　(一) 直接**荧光标记法

　　取一定量细胞(约1 × 106 细胞/ml )，直接加入连接有荧光素的抗体进行**标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，孵育20-60分钟后，用PBS(pH7.2 - 7.4)洗1-2 次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 检验地带网

　　(二) 间接**荧光标记法

　　取一定量的细胞悬液(约1X106 细胞/ml )，先加入特异的**抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的**抗体，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

　　五、质量控制和注意事项

　　流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。

　　(***式细胞术**学检测的影响因素和质量控制

　　流式细胞术在**学中有着广泛的应用，其**荧光染色的标本制备非常重要，常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接**荧光染色中)或细胞浓度低等影响检测结果。解决这些影响因素的方法如下：

　　(1) 确保标本上机检测前的浓度为1 X 106 /ml，细胞浓度过低直接影响检测结果。

　　(2) 使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合位点，尤其在间接**荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1 %胎牛血清。 www.labdd.com

　　(3) 荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。

　　(4) 设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。

　　(5) 判定结果时，应注意减去本底荧光，为使**荧光的定量分析更**，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的**荧光定量结果。

　　(6) 注意染色后避光，保证细胞**荧光的稳定。

　　(二)DNA 倍体分析的质量控制仍没有统一的标准， 各文献报道的实验结果差异较大，1 9 9 3 年1 0 月美国癌症研究组织制定了FCMDNA 测定的统一标准，我们根据这些标准并结合国内有经验的专家多年的实践，对FCM 的DNA 分析技术的质控和注意事项进行说明。

　　(1) 手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。

　　(2) 标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，D NA 降解，而造成测试结果的误差。

　　(3) 固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度，70%的乙醇固定效果较好。

　　(4) 单细胞悬液制备过程中，注意将待测细胞成分分离出来，减少其他成分的干扰，并注意不要损伤该群细胞。

　　(5) 细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度，即1X106 /ml，杂质、碎片、团块和重叠细胞应 <2%，对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品，至少有20 %的肿瘤细胞存在。(6) 石蜡包埋组织单细胞制备时要注意：取材时应选取无自溶、坏死的组织，对肿瘤组织标本，选取含肿瘤细胞丰富的区域;石蜡组织片的厚度要适宜，*好为40-50 μm 。过薄或过厚的切片均会影响检测结果;彻底脱蜡，以免残留的石蜡影响酶的消化活性，验证脱蜡是否完全的方法是弃去二甲苯，加入100%乙醇，如

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　　果无絮状物浮起，说明蜡已脱净;水化要充分，使组织还原到与新鲜组织相似的状态;注意消化的时间和消化酶的活性。常规使用0.5%胃蛋白酶，pH 1.5。

　　( 三) 操作方面

　　(1) 流式细胞仪在整个工作过程中处于*佳状态，能保证定量检测的准确性和检测精度。使用标准样品调整仪器的变异系数在*小范围，分辨率在*好状态，能避免在测量过程中仪器条件的变化引起的检测误差。

　　(2) 评价仪器精度的重要指标是仪器的变异系数(CV)，对于校准样品，其CV值越小越好，CV值越小，说明仪器校正的精度越高。校准样品包括非生物样品(荧光微球)和生物细胞样品( 人**细胞、鸡红细胞等) 。目前，非生物荧光微球已有商品试剂，CV一般<2%-3%。

　　(四) 资料分析方面

　　(1) 当样品中碎片杂质或团块过多，所测细胞数在20%以下，组方图的基线抬高时，应放弃分析处理。

　　(2) 做细胞周期分析时，样品细胞数应在1 万个，排除碎片、杂质和团块，当异倍体细胞数占总细胞数10 %以下时，需要结合其他诊断指标，不可盲目下结论，至少异倍体细胞占总细胞数的20 %以上，可以确定异倍体的存在。

　　(3) DNA分析时，正常二倍体细胞组方图CV值>8%时放弃分析，但肿瘤细胞的CV值>8%，与肿瘤细胞的异质性有关。另外，DNA倍体分析时，同源组织的不同个体会出现1 0 %的漂移。 www.labdd.com

　　(4 )DNA倍体标准的质量控制，采用相同个体同源正常组织、同样固定方法、相同的样品处理方法、相同的染色方法、同步染色、同样的仪器检测条件、正常的二倍体组织作为内标准。