碱性磷酸酶知识大全

分享到:
点击量: 202750

碱性磷酸酶简介

  碱性磷酸酶(ALP 或AKP)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团,从而使DNA或RN**段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶,而是一组同功酶。目前已发现有 AKP1、AKP2、AKP3、AKP4 、AKP5与AKP6 六种同功酶。其中第1、2、6 种均来自肝脏,第3种来自骨细胞,第4种产生于胎盘及癌细胞,而第5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。

  碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。患这些**时,肝细胞过度制造ALP,经**道和肝窦进入血液,同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍,反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。但由于骨组织中此酶亦很活跃。因此,孕妇、骨折**期、骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进时,血清碱性磷酸酶亦可升高,应加以鉴别。

  碱性磷酸酶也是目前**诊断试剂产品*常用的标记酶之一。与辣根过氧化物酶(HRP)相比,ALP用作标记酶的优点是,稳定性高、灵敏度高,缺点是成本高,标记困难。

  

碱性磷酸酶临床意义

  1.生理性增高:儿童在生理性的骨骼发育期,碱性磷酸酶活力可比正常人高1~2倍。

  2.病理性升高:

  (1) 骨骼**如佝偻病、软骨病、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移等;

  (2) 肝胆**如肝外胆道阻塞、肝癌、肝硬化、毛细胆管性肝炎等;

  (3) 其他**如甲状旁腺机能亢进。

  3. 病理性降低:见于重症慢性肾炎、儿童甲状腺机能不全、贫血等。

  

碱性磷酸酶ELISA方法

  实验原理:

  1. 在ELISA测定中,碱性磷酸酶的色原底物是对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny-phosate,pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酚(pNP),其在入=405 nm处有*大吸收。

  2. 由于较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性,所以用TBS体系,不能用含磷酸根丰富的PBS体系,否则会造成本底偏高。

  3. 由于碱性条件下pNP的光吸收增强,并可使碱性磷酸酶失活,因而可使用氢氧化钠作为终止剂。

  试剂:

  ELISA溶液体系:

  1XTBS 1L体系

  H2O 定容至1000ml

  Tris-HCl 6.06g 50mM 盐酸调 PH 7.5

  NaCl 8.76g 150mM

  包被液:

  0.1M NaHCO3 (pH9.6)。过滤**,4℃贮存。

  显色液:

  1. 0.1M glycine pH 10.4 + 1mM MgCl2 + 1mM ZnCl2

  配方:7.51g glycine + 203 mg MgCl2 + 136 mg ZnCl2 + 980 ml H2O,用浓NaOH溶液调至pH10.4,补水定容到1L。

  2. 1 M diethanolamine(二乙醇胺)pH 9.8+ 0.5mM MgCl2

  配方:97 ml of diethanolamine +100 mg MgCl2 + 800 ml H2O,用浓HCl溶液调至pH9.8,补水定容到1L。

  显色液中pNPP终浓度为1mg/ml。

  终止液:

  配方:3M NaOH。

  实验步骤:

  1. 包被:用包被液稀释靶分子,4℃过夜或者37℃ 1h。TBS洗3次。

  2. 封闭:2%M-TBS 37℃ 1h。TBS洗3次。

  3. 结合:将表达菌用TBS重悬,超声后加入到孔中,37℃ 1h。0.5%TBST洗3次。

  4. 显色:将显色液加入到孔中,3M NaOH终止(100ul显色液+25ul终止液)

  实验结论:

  两种显色液显色时间有区别,显色液1显色较慢,适合检测表达量较高或结合活性高的样本,同时实验平行性较好;显色液2显色较快,灵敏度较高。

  

荧光光度法测定血清中碱性磷酸酶

  1 引言

  碱性磷酸酶(ALP, EC3.1.3.1)的活性测定是临床上*常见的测定项目之一。血液中的ALP主要来自于肝脏和骨骼,因此在这些器官发生病变时血清ALP活力会明显增高。ALP活力测定可作为诊断某些**的辅助指标。因此,在临床诊断中简单、准确地测定血清中ALP的活性是非常重要的。测定ALP活性的方法主要有分光光度法,电化学方法、化学发光法和荧光法等。临床推荐使用的检测ALP方法是利用对硝基苯磷酸酯作为底物的分光光度法和磷酸苯二钠作为底物的氨基安替比林比色法。通常,荧光法的灵敏度较分光光度法高约两个数量级,且和分光光度法一样具有所用仪器简单、操作方便及易于实现操作自动化等优点。本实验选择水杨酸磷酸酯(SP)作为荧光底物,SP在4 ℃的低温条件下,至少可稳定一个月。在实验条件下,合成的新底物SP稳定性好,荧光背景很低。而SP被ALP水解后生成强荧光产物水杨酸(SA),反应机理如下。

  荧光分子SA中含有共轭π键且SA分子取代基之间形成氢键,从而加强了分子的刚性结构,使其荧光强度增强,且生成的SA的量与参与反应的ALP活力呈线性关系。据此建立了荧光法测定ALP活性的新方法。

  2 实验部分

  2.1 仪器

  RF540型荧光分光光度计和UV265型紫外可见分光光度计;PHS 3B型酸度计;离心机。

  2.2 试剂

  水杨酸磷酸酯(SP)合成并纯化,将10.0 g SA与15.0 g PCl5混合使之在室温下反应,直到反应平缓下来,然后用60~65 ℃水浴搅拌加热1.5 h。用冰水浴将反应混合物冷却,然后依次加入25 mL苯、25 mL丙酮和3.5 mL水。将混合物冰水冷却30 min后,加入50 mL苯,再放置24 h。经真空干燥过夜后,用丙酮和苯的混合物重结晶,可得7.99 g SP(产率约51%)。测得其熔点为163~165 ℃,与文献[15]报道的162.5~163 ℃ 基本符合。底物C、H含量用元素分析仪测定(%,括号为理论值):测得值为:C 38.50(38.54), H 3.26(3.24)。

  工作液的配制:准确称取0.1090 g SP,溶于少量0.10 mol/L TrisHCl缓冲溶液(pH 9.0)中,并以此缓冲溶液定容至500 mL容量瓶,得1.00 mmol/L工作液(可稳定一个月以上)。碱性磷酸酶(ALP,分析纯,Sigma公司,17 U/mg)储备液的配制:准确称取0.0441 g ALP,溶于少量0.10 mol/L Tris HCl 缓冲溶液(pH=9.0) 中,并以此缓冲溶液定容至250 mL容量瓶,得3.00 U/mL储备液。使用时以0.10 mol/L Tris HCl 缓冲溶液(pH 9.0)逐级稀释得工作液。水杨酸(SA,分析纯,北京化学试剂公司)工作液的配制:准确称取0.0691 g SA,溶于少量0.10 mol/L TrisHCl 缓冲溶液(pH 9.0) 中,并以此缓冲溶液定容至500 mL容量瓶,得1.00 mmol/L工作液。储备液与工作液均需置于0~4 ℃的生化培养箱内保存。

  0.10 mol/L TrisHCl 缓冲溶液(pH 9.0)。其余所用试剂均为分析纯,所有实验用水均为石英亚沸蒸馏水。

  2.3 实验方法

  于10 mL比色管中依次加入1.0 mL 1.00 mmol/L SP、2.0 mL TrisHCl 缓冲溶液(pH 9.0)和0.10 mL 0.30 U/L ALP,以石英亚沸蒸馏水定容至刻度,振荡摇匀,37.0 ℃水浴放置10 min,用1 cm荧光池(附有自动恒温装置),记录其荧光光谱。同时在λex/λem=303/412 nm测定荧光强度F,同时测定试剂空白的荧光强度F0。经过酶反应后,增强的荧光强度以ΔF(ΔF= F-F0)表示。

  3 结果与讨论

  3.1 SA和SP的荧光光谱

  酶反应后所得产物SA分子具有强的共轭π键, 刚性结构以及给电子基团(OH),因此SA荧光较强。合成的SP将SA分子中的给电子基团(OH)转化为磷酸酯基,使得SP的荧光显著减弱。单纯的SP溶液荧光很弱;在SP中加入ALP后,荧光强度显著增强且峰形与SA类似。荧光光谱说明ALP能催化SP水解,生成SA。

  3.2 反应条件的优化

  3.2.1 酸度的影响 体系酸度对酶催化反应影响见图2。由图2可见,在pH = 7.5~10.5之间,体系的ΔF先增大后减小,当pH在8.0~10.0范围时,体系的荧光强度ΔF变化不大。而在pH 8.8~9.8范围内,体系的ΔF达到*大且保持稳定,故本实验选择pH 9.0的0.10 mol/L TrisHCl缓冲体系进行进一步的研究。结果表明,加入2.0 mL缓冲溶液时,ΔF达到*大且保持稳定。

  3.2.2 底物浓度的影响 在5.0~50 μmol/L范围内,随着底物SP浓度的增大,体系的荧光强度(即反应速度)逐渐增大,当SP浓度大于50 μmol/L时,体系的荧光强度不随底物浓度的增大而变化。米氏动力学方程式[16] V=Vmax·[S]Km+[S]反映了酶反应速率与底物浓度之间的关系。

  通过LineweaverBurk 双倒数转换,得式(1):1V=KmVmax×1[S]+1Vmax(1)式中,V为初速度(mol/(min/L)),Vmax为*大反应速度,[S]为底物浓度(mol/L), Km为米氏常数(mol/L)。本研究以ΔF的值相应地代表了酶的反应速率。因此得式(2): 1ΔF=KmVmax×1[SP]+1Vmax(2)所以, 以1ΔF对1[SP]作图,得Km值为1.28×10-5 mol/L。 为了正确测得酶活力, 所选底物浓度应远大于Km值。因此,本研究选择浓度为1.00×10-4 mol/L。

  3.2.3 温度对体系荧光强度的影响 同其它酶促反应相似,ALP催化SP水解反应受温度影响较大。实验结果表明,当温度低于50 ℃时,F0随温度变化很小;当温度高于50 ℃时,F0随温度上升而迅速增加,这是由于底物自身水解的影响所造成;反应温度为30~50 ℃时,ΔF达到*大值且保持不变,本实验选择37.0 ℃进行下一步研究,这样既保证了酶活性,又与临床应用的生理环境相一致。

  3.2.4 反应时间对体系荧光强度的影响 同其它酶促反应相似,ALP催化SP水解反应受反应时间影响较大。由图4可见,随着反应时间增加,F0基本保持稳定,而F和ΔF随之增大。实验结果表明,在180 min内,体系荧光强度的增强(ΔF)与反应时间成正比。为了提高分析速度,选择孵育时间为10 min,此时已有较强的检测信号和足够的灵敏度。

  3.3 分析应用

  3.3.1 线性范围与检测限 在选定的*佳条件下,体系增强的荧光强度与ALP的活性在0.03~6.00 U/L范围内有良好的线性关系,线性方程为ΔF=76.73C+11.32,相关系数0.996。空白溶液的标准偏差为0.18时(n=11),检出限为7.04 mU/L。

  3.3.2 人血清ALP活性的测定 取人血清0.10 mL,按上述实验方法直接测定其中所含ALP的活性;同时用标准比色法(以对硝基苯磷酸酯为底物)测定该样品。与临床上常用的以对硝基苯磷酸酯为底物的比色法相比,本实验方法具有良好的准确度和精密度。

 

碱性磷酸酶的提取

  碱性磷酸酶(AKP或ALP)是一种底物特异性较低,在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶,需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性,能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上,如磷酸基团的接受体是水,则其作用就是水解。·KP*适PH范围为8.6-10,动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝,小部分来自骨骼。

  AKP可从组织中分离纯化,也可以采用基因工程表达的方式获得:将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体,转入宿主菌中进行重组表达,并从表达菌提取,并进行酶动力学分析。

  

碱性磷酸酶的分离纯化及采用的技术

  AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似,常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用,才能得到高纯度的酶蛋白。其中,用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大(20℃,每升可溶760克),并且对许多酶没有很大的影响,因此它是*常用的盐。

  

碱性磷酸酶的纯度检测

  酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。根据国际酶学委员会规定,酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示,单位(U/mg?pr)来表示。因此,测定样品的比活性必须测定:a每毫升样品中的蛋白质毫克数;b每毫升样品中的酶活性单位数。

  在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活,为了获得较好的分离提取效果,在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大,提纯步骤才有效。