氨基酸分析知识大全

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氨基酸分析类型

  氨基酸分析按其分离和检测方法的不同可分为三大类型

  1、**类是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法(IEC)。此类方法由Stein 和Moore 两人1958 年发明,并于1972年获诺贝尔奖,是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。

  原理: 阳离子交换分离、柱后茚三酮衍生光度法测定

  衍生试剂: 茚三酮

  基体干扰: 无

  多余试剂: 不干扰

  检测器: 可见光

  检测限: 5-10 pmol

  优点: 方法成熟可靠。稳定性、重现性、线性均优于HPLC法,柱子寿命长,几乎可分析已知的所有氨基酸(*多可同时分离50 余种)

  缺点: 对大多数氨基酸的灵敏度不如HPLC 法和IC法。仪器专用化,售价较高

  2、**类是所有基于反相色谱分离、柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相法(HPLC)

  原理: 高效液相反相色谱分离、柱前衍生、光度法测定
 

衍生试剂 PITC   OPA    FMOC   AQC  DABS-Cl
基体干扰
多余试剂 需除去 不干扰   需除去 不干扰   需除去
检测器 UV  荧光 荧光 荧光 UV 
检测限 30 pmol 1 pmol 1 pmol 1 pmol 30 pmol

  优点: 对一些氨基酸有很高的灵敏度,分析时间较短,仪器可一机多用

  缺点: 衍生反应和产物稳定性常受基体和过量试剂干扰,方法的稳定性、重现性、线性和可靠性不如茚三酮法,能分离分析的氨基酸种类较少。且柱子寿命短,衍生试剂一般较贵,方法对操作技术要求高。

  PITC异硫氰酸苯酯;OPA邻苯二甲醛;FMOC 9-芴基甲氧羰酰氯;AQC 6-氨基-喹啉基-N-羟基琥贝酰亚胺-氨基甲酸酯;DABS-Cl 二甲基氨基偶氮苯磺酰氯

  3、第三类是阴离子交换分离直接安培法检测的离子色谱法IC,严格说来,阴离子交换和阳离子交换都叫“IEC”,在此将阴离子交换分离、安培检测的方法归类为IC

  原理: 阴离子交换直接测定

  衍生试剂: 无

  基体干扰: 有

  多余试剂: 无

  检测器: 脉冲安培

  检测限: 0.5pmol

  优点: 对一些氨基酸有很高的灵敏度,分析时间较短,仪器可一机多用

  缺点: 易受**干扰,测量结果与茚三酮法有较大差异,稳定性、重现性与HPLC法接近

  

氨基酸分析方法和仪器的选择

  氨基酸分析的方法和仪器多种多样,用户应该根据自己的实际应用情况和发展趋势来选择方法和仪器。选择时可参考以下几个方面:

  1、 是否需要对分析结果负责(如对外出具报告等)

  IEC 仪器使用茚三酮柱后衍生法,符合国家标准和国际仲裁标准,而IC 法和HPLC 法虽然总体性能也比较稳定可靠,但其测量结果与茚三酮法有较大差异,且结果难以长期重复,这对于仲裁不利。目前,IC法和HPLC法分析氨基酸一般仅用于不太深入的研究,而且主要是利用其灵敏度较高的特性。也有部分企业用来做内部质量控制(国家没有制定相关标准),但如果要考虑对外做样并出具结果报告,IEC仪器是**选择。由于国内的氨基酸分析呈现急剧上升的势,而很多单位经济能力有限,因此也确有不少单位购买专用氨基酸分析仪作为创收手段。

  2、 一次进样需要出峰的数量是多还是少

  氨基酸种类繁多、性质接近,因此氨基酸分析是色谱界公认的难题,尽管现在有多种多样的方法,但没有任何方法能够保证所有氨基酸峰能够一次进样完全的分离。仅仅从分离程度来说,好的HPLC方法*多可以一次分离检测20种左右的氨基酸峰,IC法*多可一次分离检测约30 种氨基酸峰(理论上说来,IC 法可达到与IEC 法相当的出峰数量,但金电极的基线漂移较大,保留时间太长的峰就难以定量分析),IEC法*多一次可分离检测50 种左右的氨基酸峰。从这个角度来说,如果您需要分析游离氨基酸样品,就应当选择IEC仪器。

  3、 氨基酸分析频率高还是低

  氨基酸样品分析频率如果达到每个星期至少1 次,就可以算“频率较高”,少于每周1 次就可以说是“较低”。频率较高时,应当仪器专用化(即便是用HPLC 和IC 法,也应专用于氨基酸分析),因为反复更换柱子和缓冲体系不仅麻烦、平衡时间长,难以保证分析结果的可靠性和重复性,而且容易损坏仪器。

  4、 氨基酸样品总量是多还是少

  总体的成本应考虑到做样成本,而不能只看仪器本身。HPLC做氨基酸分析时,每根柱子只能进样100-500 针,而IEC 仪器的柱子都超过1000 针(sykam柱子使用国产试剂时大于2000 针,使用进口试剂时大于4000针)。

  如果都使用国产试剂,HPLC 仪器单针成本平均160 元人民币,IEC 仪器单针成本平均20 元人民币,IC 仪器单针成本平均60 元人民币(IC 法无需衍生剂,但检测电极是消耗品)。此处计算了标样、缓冲溶液、衍生剂、柱子等消耗品价格,而仪器的维护保养费用相同(未计算)。下表是专用氨基酸分析仪IEC、HPLC和IC(都配置自动进样,HPLC加配氨基酸分析包)的总成本分析。

  

游离氨基酸分析样品前处理方法(除蛋白)

  1、固体样品:**称取样品­__mg加入10ml5%的磺基水杨酸沉淀2小时。吸取一定的量于10000rpm/min离心15分钟。取一定体积的上清液调pH至2左右定容(参考方法一份上清液加3份水),用0.45μm微膜过滤至样品杯中上机测定。

  2、液体样品:****吸取样品­__ml加入等体积的10%的磺基水杨酸沉淀2小时。吸取一定的量于10000rpm/min离心15分钟。取一定体积的上清液调pH至2左右定容(参考方法一份上清液加3份水),用0.45μm微膜过滤至样品杯中上机测定。

  附:游离氨基酸分析送样要求

  1、 样品应澄清,无可见渣子,放置或离心后不产生沉淀。

  2、 样品液应无色或仅为淡黄***深样品必须经过脱色处理。

  3、 含盐量低。样品液中的总离子强度不应大于0.5N。含盐量过高必须经过脱盐处理。

  含蛋白或多肽类物质必须除去。样品需经0.45微米的滤膜过滤。pH应控制在2左右。

  

氨基酸分析仪器

  我们已经比较了 HPLC、IC 和 IEC 这三大类氨基酸分析方法,总的说来,它们适合不同情况下的应用,虽然IEC 茚三酮柱后衍生法适应范围更广泛,但仪器售价也明显要高。目前中国市场上号称是专用氨基酸分析仪的有很多,对于用户而言,也未必需要去分辩谁是真正 的专用氨基酸分析仪, 而且国家仪器名录甚至国际上都没有明确提出专用氨基酸分析仪的定义,但在中国市场,无论是使用者还是仪器厂家,一般都是把阳离子交换分离、茚三酮柱后衍生法仪器叫作“氨基酸分析仪”。这类仪器技术门槛较高,国内目前还没有厂家生产此类仪器, 代表厂商有德国 sykam、日本 hitachi等。IC法仪器的代表是Dionex公司的 AAA-direct。