生物芯片知识大全

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生物芯片概述

  生物芯片,又称DNA芯片或基因芯片,它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。

  生物芯片技术起源于核酸分子杂交。所谓生物芯片一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子(如基因片段、CDN**段或多肽、蛋白质)的微阵列杂交型芯片(micro-arrays),阵列中每个分子的序列及位置都是已知的,并且是预先设定好的序列点阵。微流控芯片(microfluidic chips)和液态生物芯片是比微阵列芯片后发展的生物芯片新技术,生物芯片技术是系统生物技术的基本内容。

  生物芯片(biochip或bioarray)是根据生物分子间特异相互作用的原理,将生化分析过程集成于芯片表面,从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。狭义的生物芯片概念是指通过不同方法将生物分子(寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、抗体、抗原等)固着于硅片、玻璃片(珠)、塑料片(珠)、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵。因此生物芯片技术又称微陈列(microarray)技术,含有大量生物信息的固相基质称为微阵列,又称生物芯片。生物芯片在此类芯片的基础上又发展出微流体芯片(microfluidics chip),亦称微电子芯片(microelectronic chip),也就是缩微实验室芯片。

  什么是生物芯片呢?简单说,生物芯片就是在一块玻璃片、硅片、尼龙膜等材料上放上生物样品,然后由一种仪器收集信号,用计算机分析数据结果。像花布一样五彩斑斓的生物芯片人们可能很容易把生物芯片与电子芯片联系起来,虽然,生物芯片和电子芯片确实有着千丝万缕的联系,但它们是完全不同的两种东西。生物芯片并不等同于电子芯片,只是借用概念,它的原名叫“核酸微阵列”,因为它上面的反应是在交叉的纵列中所发生。

  芯片的概念取之于集成的概念,如电子芯片的意思就是把大的东西变成小的东西,集成在一起。生物芯片也是集成,不过是生物材料的集成。像实验室检测一样,在生物芯片上检查血糖、蛋白、酶活性等,是基于同样的生物反应原理。所以生物芯片就是一个载体平台。这个平台的材料则有很多种,如硅,玻璃,膜(纤维素膜)等,还有一些三维结构的多聚体,平台上则密密麻麻地摆满了各种生物材料。芯片只是一个载体。做什么东西、检测什么,还是靠生物学家来完成。也就是说,原来要在很大的实验室中需要很多个试管的反应,现在被移至一张芯片上同时发生了。

  

生物芯片的分类

  生物芯片虽然只有10多年的历史,但包含的种类较多,分类方式和种类也没有完全的统一。

  一、根据用途分类

  (1)生物电子芯片:用于生物计算机等生物电子产品的制造。

  (2)生物分析芯片:用于各种生物大分子、细胞、组织的操作以及生物化学反应的检测。

  前一类目前在技术和应用上很不成熟,一般情况下所指的生物芯片主要为生物分析芯片。

  二、根据作用方式分类

  (1)主动式芯片:是指把生物实验中的样本处理纯化、反应标记及检测等多个实验步骤集成,通过一步反应就可主动完成。其特点是快速、操作简单,因此有人又将它称为功能生物芯片。主要包括微流体芯片(microftuidic chip)和缩微芯片实验室(lab on chip,也叫“芯片实验室”,是生物芯片技术的高境界)。

  (2)被动式芯片:即各种微阵列芯片,是指把生物实验中的多个实验集成,但操作步骤不变。其特点是高度的并行性,目前的大部分芯片属于此类。由于这类芯片主要是获得大量的生物大分子信息,*终通过生物信息学进行数据挖掘分析,因此这类芯片又称为信息生物芯片。包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片。

  三、根据固定在载体上的物质成分分类

  (1)基因芯片(gene chip):又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray),是将cDNA或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上制成。

  (2)蛋白质芯片(protein chip或protein microarray):是将蛋白质或抗原等一些非核酸生命物质按微阵列方式固定在微型载体上获得。

  (3)细胞芯片(cell chip):是将细胞按照特定的方式固定在载体上,用来检测细胞间相互影响或相互作用。

  (4)组织芯片(tissue chip):是将组织切片等按照特定的方式固定在载体上,用来进行**组织化学等组织内成分差异研究。

  (5)其他:如芯片实验室(Lab on chip),用于生命物质的分离、检测的微型化芯片。现在,已经有不少的研究人员试图将整个生化检测分析过程缩微到芯片上,形成所谓的“芯片实验室” (Lab on chip)。芯片实验室是生物芯片技术发展的*终目标。它将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室已经问世,并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的芯片)。“芯片实验室”可以完成诸如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作。这些微型集成化分析系统携带方便,可用于紧急场合、野外操作甚至放在航天器上。例如可以将样品的制备和PCR扩增反应同时完成于一块小小的芯片之上。再如Gene Logic公司设计制造的生物芯片可以从待检样品中分离出DNA或RNA,并对其进行荧光标记,然后当样品流过固定于栅栏状微通道内的寡核苷酸探针时便可捕获与之互补的靶核酸序列。应用其自己开发的检测设备即可实现对杂交结果的检测与分析。这种芯片由于寡核苷酸探针具有较大的吸附表面积,所以可以灵敏地检测到稀有基因的变化。同时,由于该芯片设计的微通道具有浓缩和富集作用,所以可以加速杂交反应,缩短测试时间,从而降低了测试成本。

  

生物芯片的技术核心

  有的生物芯片技术都包含四个基本要点:芯片的制作、杂交或反应、测定或扫描、数据处理。生物芯片的技术核心是芯片的制备及反应信号的检测。

  1、芯片制备技术

  目前制备芯片的方法基本上可分为两大类:一类是原位合成(in situ Synthesis);一类是合成后交联(post-synthesis attachment)。原位合成是目前制造高密度寡核苷酸芯片*为成功的方法。在制备基因芯片时要考虑阵列的密度、再生性、操作的简便性、成本的高低等几方面的因素。

  具体而言,比较典型的DNA芯片制备方法有4种:**种方法是Affymetrix公司开发的光引导原位合成法,该方法是微加工技术中光刻工艺与光化学合成法相结合的产物。**种方法是Incyte Pharmaceutical公司采用的化学喷射法,该方法是将合成好的核昔酸探针定点喷射到芯片上并加以固定化来制作DNA芯片。第三种方法是斯坦福大学研制的接触式点涂法。在DNA芯片制备中通过高速精密机械手的**移动让移液头与玻璃芯片接触,而将DNA探针涂敷在芯片上。第四种方法是通过使用4支分别装有A,T,G,C核昔的压电喷头在芯片上并行地合成出DNA探针。

  光引导合成法与喷墨打印法、合成点样法相比,*大的优点是,它可以合成密度极高的阵列;但它的*大缺点是耗时、操作复杂,而且为保证在不同位点加上不同的单体,从而在不同的位点合成不同的探针,需要不断更换不同的蔽光膜,对一个含25个碱基的探针的微阵列,一般需更换100个蔽光膜,需**多的时间才能完成。合成点样法虽然芯片上探针的密度相对较低,每个样品都要预合成、纯化,在芯片制备前还需妥善保存合成的探针,但是它的*大优点是操作简便。目前很多公司采用这种方法来制备芯片。

  2、样品制备技术

  生物样品往往是各种组分的混合体,成分非常复杂,由于目前的检测体系还不能检测出未扩增的标记样品,所以待测样品DNA在杂交前一般都要进行聚合酶链反应(PCR),在扩增的过程中,对靶DNA进行标记。目前DNA样品的扩增一般是通过液相反应来完成,但由于低浓度核酸很难检测到,在溶液中通过PCR反应获得线性扩增也很困难;另外,不同靶DNA对引物的竞争,意味着某一序列的扩增优于其他序列。为了解决上述问题,一些公司正在研究新的方法。如固相PCR系统,该系统是将2种引物排列在丙烯酰胺膜上,与DNA样品、PCR试剂混合,如样品含有靶序列,则开始扩增反应;通过这种固相PCR体系,可避免对引物的竞争,同时也降低了**污染。不过也有不少人试图绕过样品扩增这一问题,如 Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法,引物特异性强,无交叉污染并且省去了液相处理的烦琐; Lynx Therapeutics 公司引入的大规模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ,可在一个样品中同时对数以万计的 DN***段进行克隆,且无需单独处理和分离每个克隆。

  在芯片飞速发展的今天,样品制备已经成为芯片发展的瓶颈所在。对于较大规模制作芯片的用户,由于点样样品数目太多,即使采用高通量试剂盒还是不够方便。世界上声誉**的核酸纯化供应商德国QIAGEN公司推出了全自动核酸和蛋白纯化工作站,该工作站有4个不同的自动纯化系统型号:BioRobot 8000,BioRobot 3000,BioRobot 9604,BioRobot 9600,加上QIAGEN**的多种配套纯化试剂盒--从质粒、粘粒、RNA、血液基因组DNA、病毒DNA到蛋白,品种丰富,在欧美的生物医学市场上掀起了一场**,各大分子生物学中心、芯片中心、医学中心争相**。

  样品获得后要进行标记,目前样品的标记主要是荧光标记。荧光标记基本分为2种,一种是使用荧光标记的引物,一种是使用荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸。目前常使用的荧光物质有:荧光素、罗丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根据扩增产物分离的方法不同,标记的方法也不同:进行单引物标记的,其扩增产物通常由聚丙烯酰胺凝胶电泳分离;对一个引物用生物素标记,另一个引物用荧光素标记的,一般用亲合素偶联的磁珠捕捉其扩增产物,通过变性处理使荧光标记的产物解链。此外,也有用生物素残基标记引物,将生物素标记的扩增产物与芯片杂交,洗涤后加入亲合素连接的荧光物,通过生物素与亲合素的结合及靶序列与探针的结合产生荧光信号,然后利用荧光检测系统对荧光信号进行检测。

  3、芯片点样技术

  点样法是将预先通过液相化学大量合成好的探针、或PCR技术扩增cDNA或基因组DNA经纯化、定量分析后,通过由阵列***(arraying and replicating device,ARD)或阵列点样机(arrayer)及电脑控制的机器人,准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上(支持物应事先进行特定处理,例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷),再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。

  点样的方式分两种,其一为接触式点样,即点样针直接与固相支持物表面接触,将DNA样品留在固相支持物上;其二为非接触式点样,即喷点,它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法的优点是探针密度高,通常1平方厘米可打印2,500个探针;缺点是定量准确性及重现性不好,打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确,重现性好,使用寿命长;缺点是喷印的斑点大,因此探针密度低,通常只有1平方厘米400点。点样机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印头、一个减震底座,上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。

  现在已经有比较成型的点样装置出售,例如美国Biodot公司的“喷印”仪,以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”仪。这些自动化仪器依据所配备的“打印”或“喷印”针将生物大分子从多孔板吸出直接“打印”或“喷印”于芯片片基上。“打印”时针头与芯片片基表面发生接触而“喷印”时针头与片基表面保持一定的距离。所以,“打印”仪适宜制作较高密度的微阵列(例如2500点/cm2),“喷印”法由于“喷印”的斑点较大,所以只能形成较低密度的探针阵列,通常400点/cm2。点样法制作芯片的工艺比较简单便于掌握、分析设备易于获取,适宜用户按照自己的需要灵活机动地设计微点阵,用于科研和实践工作。目前,除了在生物芯片研制方面享有盛誉的Affymetrix公司等个别公司使用原位合成技术制造芯片外,大多中小型公司普遍采用点样技术制作生物芯片。

  4、探针的制备技术

  探针(探针的功能是识别靶序列和携带报告分子(如同位素、荧光、地高辛等)):为了提高监测灵敏度,人们的努力放在信号放大以及模板扩增两个方面,其中应用经过特殊处理的探针方法可以提高灵敏度的方法有三种:分支探针这种方法的原理是,设计具有庞大分支结构的分支核苷酸探针,分支末端以酶标记。这样,经过分支核苷酸与酶的双重放大作用而将标本杂交时极弱的信号转换为较强的化学信号。)、分子信标(Molecular beacon, MB,一种设计巧妙的荧光标记的��酸探针,未杂交状态下为发夹结构,在发夹的两端分别连接荧光素分子和猝灭分子,利用荧光共振能量转移原理(FRET))、肽核酸(Peptide nucleic acids, PNA,以中性酰胺键为骨架,不带电荷,为DNA类似物。与DNA的亲和性高、酶解稳定性好,因此多用来做诊断和检测用探针)探针3项技术。

  5、杂交反应及过程控制技术

  芯片杂交是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外*重要的一步。杂交时选择的条件要使成千上万对的杂交反应中的*大多数处于*佳状态中,也就是说要使得尽可能多的正确配对物都不遗漏(假阴性尽可能少),有错配的杂交降低至*低(假阳性尽量少),这是非常难以达到的境界。

  目前杂交是提高芯片在实际应用中的准确性的关键步骤之一。杂交条件的构建要根据芯片的实际情况进行**化。

  杂交反应是一个复杂的过程,受很多因素的影响,而杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的准确性。这些影响因素包括:(1)寡核苷酸探针密度的影响。低覆盖率使杂交信号减弱,而过高的覆盖率会造成相邻探针之间的杂交干扰。(2)支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。研究表明当间隔序列长度提高到15个寡核苷酸时杂交信号显著增强。有研究表明,选择合适长度的间隔序列,可使杂交信号增强150倍。(3)杂交序列长度的影响。在杂交反应中经常发生碱基错配现象,区分正常配对的互补复合物与单个或2个碱基的错配形成的复合物,主要依赖于形成的复合物的稳定性不同,而杂交序列的长度是影响复合物稳定性的一个重要因素,一般说来,短的杂交序列更容易区分碱基的错配,但复合物的稳定性要差一些;而长杂交序列形成的复合物稳定,而区分碱基错配能力要差一些。研究表明,12、15、20个碱基产生的杂交信号强度接近,但15个碱基的杂交序列区分错配碱基****。(4)GC含量的影响。GC含量不同的序列其复合物的稳定性也不同。(5)探针浓度的影响。以凝胶为支持介质的芯片,提高了寡核苷酸的浓度,在胶内进行的杂交更象在液相中进行的杂交反应,这些因素提高了对错配碱基的分辨率,同时也提高了芯片检测的灵敏度。(6)核酸二级结构的影响。在使用凝胶作为支持介质时,单链核酸越长,则样品进入凝胶单元的时间越长,也就越容易形成链内二级结构从而影响其与芯片上探针的杂交,因而样品制备过程中,对核酸的片段化处理,不仅可提高杂交信号的强度,还可提高杂交速度。

  6、杂交图谱的信号检测技术

  杂交图谱的信号检测是生物芯片的两个关键技术之一,目前关于芯片的大量**和研究集中在这方面。荧光检测主要有2种:激光共聚焦荧光显微扫描和CCD荧光显微照相检测。前者检测灵敏度、分辨率均较高,但扫描时间长;后者扫描时间短,但灵敏度和分辨率不如前者。虽然荧光检测在芯片技术中得到了广泛的应用,但是荧光标记的靶DNA只要结合到芯片上就会产生荧光信号,而目前的检测系统还不能区分来自某一位点的荧光信号是由正常配对产生的,还是单个或2个碱基的错配产生的,或者兼而有之,甚或是由非特异性吸附产生的,因而目前的荧光检测系统还有待于进一步完善与发展。有研究者正试图绕过荧光标记,建立新的检测系统,以提高杂交信号检测的灵敏度。

  比较成熟的是采用激光系统扫描仪进行的荧光检测,噪音水平、信噪比、分辨率是衡量扫描仪工作质量的几个重要指标。由于荧光标记法的灵敏度相对较低,因此质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等等正作为新的芯片标记和检测方法处于研究和试验阶段,其中*有前途的当推质谱法。

  目前有很多厂商生产生物芯片信号检测扫描仪,知名的公司包括:Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic âMicrosystems公司、Axon Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片扫描检测系统中的领头产品。2000年GSI并入**的Parkard公司后ScanArray的软、硬件都得到进一步加强。

  7、信号(信息)分析与解读——数据分析

  芯片杂交图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成。一个完整的生物芯片配套软件应包括生物芯片扫描仪的硬件控制软件、生物芯片的图像处理团建、数据提取(mining)或统计分析软件,芯片表达基因的国际互联网上检索和表达基因数据库分析和积累。

  从国际上生物芯片**的按领域分布来看,62%的**集中在数据分析领域,可见如何对生物芯片带来的海量数据进行解读、分析是生物芯片研究领域的焦点和重点。

  对所读取的数据的处理方面,目前已经有许多数学统计的方法用于芯片数据处理与信息提取,应用*广泛的是聚类分析(cluster analysis)、此外还有主成分分析(principal component analysis)、时间序列分析(time series analysis)等,但是还没有一种“标准”的统计方法。

  

生物芯片的应用领域

  1、基因表达水平的检测

  用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。谢纳(M.Schena) 等用人外周血**细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列,来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异,发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达,11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在 HGP完成之后,用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。

  2、基因诊断

  从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱,就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点,将成为一项现代化诊断新技术。例如 Affymetrix公司,把p53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上,制成p53基因芯片,将在癌症早期诊断中发挥作用。又如,Heller等构建了96个基因的cDNA微阵,用于检测分析风湿性关节炎(RA)相关的基因,以探讨DNA芯片在感染性**诊断方面的应用。

  3、**筛选

  利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再cDNA表达文库得到的肽库制作肽芯片,则可以从众多的**成分中筛选到起作用的部分物质。还有,利用RNA、单链DNA有很大的柔性,能形成复杂的空间结构,更有利与靶分子相结合,可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上,然后与靶蛋白孵育,形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物,可以筛选特异的**蛋白或核酸,因此芯片技术和RNA库的结合在**筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV**中,Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸,并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物,实验表明,这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。生物芯片技术使得**筛选,靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高,成本大大降低。

  4、个体化医疗

  临床上,同样**的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用,而对病人丙则可能有副作用。在**疗效与副作用方面,病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异(单核苷酸多态性,SNP),导致对**产生不同的反应。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断,再开**,就可对病人实施个体优化**。另一方面,在**中,很多同种**的具体病因是因人而异的,用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型,HBV基因的多个位点如S、P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次,这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。

  5、测序

  基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列,这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。研究人员用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列,准确率达99%。用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异,结果发现在外显子约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间,提示了二者在进化上的高度相似性。

  6、生物信息学研究

  人类基因组计划是人类为了认识自己而进行的一项伟大而影响深远的研究计划。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能,只有知道其功能才能真正体现HGP计划的价值--破译人类基因这部天书。后基因组计划、蛋白组计划、**基因组计划等概念就是为实现这一目标而提出的。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。生物芯片技术就是为实现这一环节而建立的,使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能,必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台,成为基因组信息学研究的主要技术支撑。生物芯片作为生物信息学的主要技术支撑和操作平台,其广阔的发展空间就不言而喻。

  在实际应用方面,生物芯片技术可广泛应用于**诊断和**、**基因组图谱、**筛选、中**种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类**的诊断、**和防治开辟全新的途径,为生物大分子的全新设计和**开发中先导化合物的快速筛选和**基因组学研究提供技术支撑平台,这从我国99年3月国家科学技术部刚起草的《医药生物技术“十五”及2015年规划》中便可见一斑:规划所列十五个关键技术项目中,就有八个项目(基因组学技术、重大**相关基因的分离和功能研究、基因**工程、基因**技术、生物信息学技术、组合生物合成技术、新型诊断技术、蛋白质组学和生物芯片技术)要使用生物芯片。生物芯片技术被单列作为一个专门项目进行规划。总之,生物芯片技术在医学、生命科学、药业、农业、环境科学等凡与生命活动有关的领域中均具有重大的应用前景。