硅胶柱层析原理

　　硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。

硅胶柱层析流动相

　　极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统;极性较大的用甲醇：氯仿系统;极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统;拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸

硅胶柱层析惯用方法

　　1.称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量;如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。

　　2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌;如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。

　　3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚(氯仿)，装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚(氯仿)将其冲入柱中。

　　4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。

　　5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。

　　6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分;1-2g上样量，50g硅胶(200-300目)，20-50ml收一馏分。

　　7.检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。

　　8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的*后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。

装硅胶柱操作步骤

　　1、 装柱

　　柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密(太密了淋洗剂走的太慢)，一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来)。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废!

　　2、 加样

　　用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离(2～4cm就够了)，再加压，这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。

　　3、 淋洗剂的选择

　　感觉上要使所需点在rf0.2～0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如(0.2/0.3)的三次方或四次方大。

　　4、 样品的收集

　　用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品，wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。

　　5、*后的处理

　　柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，*好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。

　　另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚(60~90),而乙醚却要选择30-60的石油醚。二是：不论是用带砂板的还是塞棉花的，在装柱之前，都要将空气用加压的方法将空气排干，这样就可避免柱中有空气!过柱子需要耐心，不要着急。

装硅胶柱产生气泡的处理办法

　　在装柱前浸润硅胶时，超声处理一段时间，可排除硅胶内部孔隙存的气体：

　　在溶胀硅胶时(将适量的硅胶和溶剂混合均匀，容易挥发的溶剂用量稍微多一些)，一般装在一烧杯中，放在超声波处理里，开启超声，这时你能看到有气泡从烧杯中出现，*好同时，用玻棒搅拌，使硅胶悬浮起来，持续十几分钟就行，不要让硅胶干掉，拿出来后就可装柱了。

装硅胶柱的注意事项

　　1) 装硅胶柱子时不要分次把硅胶倒入，要一次就全部倒入，而且倒时要均匀。

　　2) 硅胶在乙酸乙酯和石油醚体系中的死体积大概是硅胶重量的2-3倍之间，自己算一下要用多大的柱子。*好选用粗短的柱子，这样使样品层比较薄，减小原始峰宽，提高分离效果。

　　3) 柱子的界面一定要平。