荧光原位杂交介绍

　　荧光原位杂交方法是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针和分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。

　　荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过**细胞化学过程连接上荧光染料[1,2].FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有**、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核. 同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术.

　　对于利用rRNA的荧光原位杂交来说，如下原因可导致较低的荧光信号强度：

　　较低的细胞核糖体含量

　　较低的细胞周边的通透性

　　较低的目标序列可接触性(由于rRNA的折叠产生的构象，有些位置与rRNA分子内其他链或其他rRNA或蛋白紧密接触，从而使探针无法和目标序列杂交)

　　为检验细胞中的目标序列是否容易被探针杂交，及测试*佳杂交温度，可利用“克隆荧光原位杂交”(clone-FISH)进行试验：将rRNA基因结合入质粒，转化至大肠杆菌中表达，构成核糖体，再用荧光标记的探针杂交。

　　FISH可与流式细胞术联用，对特定荧光标记的细胞进行计数或者分离。

荧光原位杂交技术

　　荧光原位杂交是一项非常神奇的技术，它是在染色体的水平上研究基因的改变，是细胞水平和基因水平之间的一座桥梁，它既能分析中期染色体水平的异常，也能分析间期核的异常，因此在很大程度上弥补了染色体核型分析的一些不足。血液病很多亚型在做染色体核型分析时，由于种种原因，比如三系减低的患者、再障或MDS的患者，受化疗影响的患者，**初发时高白细胞的患者，骨髓取材不足或不佳的患者，等等原因而致细胞生长**，可供分析的中期分裂相特别少，有时就无法进行染色体核型分析，还有染色体分裂指数非常低的患者(多发性骨髓瘤和慢淋)，往往也捕获不到异常细胞的分裂相，这时，荧光原位杂交技术就发挥巨大的作用啦!它在间期核上就可分析有无异常改变，而且一分析就是成百上千的细胞，远远大于染色体核型分析的数目。尤其对多发性骨髓瘤和慢淋患者，它更有检测上的优势，异常的检出率远远大于核型分析(70-85%对20-30%)。我们实验室目前不但有多发性骨髓瘤、慢淋和MDS的组合探针，还有林林总总其他各类探针30余种。现在，在骨髓涂片上也可进行荧光原位杂交，它正在发挥着越来越大的作用。

　　一、荧光原位杂交技术原理

　　以荧光素标记取代同位素标记而形成的核酸探针，依据碱基配对原理，通过**细胞化学检测体系在组织切片，细胞间期核或染色体等标本上进行DNA的定性、定位及定量分析。FISH具有快速、**、灵敏度高，特异性强等优点，不仅能显示于染色体中期分裂相，还能显示于间期核细胞。

　　二、荧光原位杂交技术临床应用

　　1、临床细胞遗传学：有助于进一步证实染色体带型，用于确定标记染色体的起源。对于染色体亚显微缺失的检测很敏感，由于诊断显微缺失综合征。

　　2、产前诊断：染色体异常的产前诊断主要依靠细胞分裂中期染色体的分析，但这一常规细胞遗传学方法需要两至三周完成。而应用生物素标记的染色体特异性探针对未经培养的绒毛细胞或羊水细胞进行原位交杂即可快速诊断常见的三体型及性染色体数目畸变。使用这一方法进行染色体数目异常的产前诊断只需要**的时间，可以省去复杂的细胞培养及染色体分析过程。另外，FISHA在染色体结构异常的产前诊断中，不仅对那些易位性重排，而且对重复，缺失或者插入性重排都能为确定类型，来源和断裂点提供可靠依据。对标记染色体，环状染色体来源的研究中，FISH也具有高度的敏感性和可靠性。

　　3、肿瘤诊断：肿瘤细胞的染色体常常发生易位、缺失、倒位与扩增等改变，而肿瘤细胞的分裂指数较低而且分裂相显带困难，经常很难分析。染色体荧光原位杂交技术的应用，使大部分上述改变的阐明大为简化。

　　4、传染性**的诊断：诊断病原体的程序已有报告。

荧光原位杂交(FISH)技术适用范围

　　荧光原位杂交广泛应用于人、动物和植物等各种生物的中期分裂相和间期细胞的荧光原位杂交图像分析，人类中期分裂相染色体核型分析，染色体异常综合征(额外小染色体、微缺失或重复等)，染色体涂染(chromosome painting)， 基因或DN**段的染色体定位，标记染色体(白血病、实体肿瘤等)，分子病理学(组织切片)，肿瘤遗传学，细胞涂片(绒毛、精子、卵裂球PGD等)，脱落细胞收集制片(羊水等)

荧光原位杂交特点

　　1、各种颜色荧光图像采集,无限种颜色添加与修正，无限种颜色信号与图像合成，图像捕获时可自动或手动调节曝光时间，弱荧光信号智能效果增强，增强荧光信号、祛除背景杂质，通用于间期/中期分裂相FISH图中的信号进行定位，G、R、DAPI带全自动核型配对分析，自动进行多荧光信号点计数，景深扩展多层次荧光信号共聚焦，自动或手动测量长度与面积等参数，加入注释文字，图像和文字资料储存于专业图像数据库中，灵活设置的分析报告内容和格式，各种储存数据的快速检索。

　　2、荧光原位杂交(程序提供所有工具以非常快速和简单的方式从荧光原位杂交标本中捕获图像。FISH程序可以根据涉及的分析类型创建许多荧色物清单。它也可以根据市场添加新的荧色物，以便覆盖所有不同类型的分析。在捕获过程中，系统控制摄像头，特别是曝光，以便捕获非常微弱模糊的信号。

　　3、荧光原位杂交捕获到的荧光图像是黑白色的。捕获之后，系统会自动显示为每个荧色物加上假彩色的融合图像;不管怎样，该系统也可以始终检查从每个荧光板上获取的原始黑白图像。根据系统数据库的模块化，它也提供范围广泛的打印布局格式。使用者可以自己创建布局，自己根据数据和图像决定什么将会显示在打印布局里。它可以存储许多不同的文件，以便包含实验室的所有要求。

　　4、在打印中，可以混合所有的技术，如明场、荧光和荧光原位杂交。

　　5、荧光原位杂交也可以编辑荧色物列表。

　　6、对每个荧色物来说，系统存储以下：偏移、整合时间、颜色。捕获过程之后，系统提供很多工具来处理图像，以便达到*佳的对照度。精密复杂的算法也已经研发用于加强DAPI反像。

　　7、如果显微镜有任何移动，荧光原位杂交系统能调节图像并存储更改值到荧色物列表内。

　　8、在融合图像上，程序可以为每个点测量荧光的强度;该测量可以为每个细胞、玻片盒病例存储下来，或者导出到Excel，以便用于统计分析。所有的荧光原位杂交图像可以一起打印或者与其他类型的图像或数据混合。

荧光原位杂交(FISH)实验步骤

　　一、仪器设备

　　1、 医用微波炉;

　　2、 水浴锅;

　　3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜;

　　4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。

　　二、FISH试剂

　　(1)1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃;

　　(2)20×SSC(pH7.0);

　　(3)2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成;

　　(4)25mg/ml蛋白酶K消化液。

　　(5)变性液(70%甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC;8ml蒸馏水;28ml甲酰胺。每次新鲜配制。

　　(6)杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml;蒸馏水16ml;甲酰胺20ml。每次新鲜配制。升至室温调节pH。

　　三、实验步骤

　　1、脱蜡：

　　1)二甲苯脱蜡3次，每次5min;

　　2)100%酒精两次，每次2min;

　　3)移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

　　2、蛋白酶处理:

　　1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

　　2) 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。

　　3) ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

　　4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。

　　3、变性：

　　1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液;

　　2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸;

　　3)78℃孵育8min;

　　4) 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min;

　　5)空气干燥。

　　4、杂交：

　　四、PRINS步骤

　　1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS;

　　2、用0.2mol/L盐酸处理5min;

　　3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min;

　　4、分别用80%，95%和100%酒精脱水，室温干片;

　　5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片;

　　6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min;

　　7、用0.1×SSC液，65℃洗5min;

　　8、片于65℃ 10s～20s;用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5min，2次;

　　9、经Buffer I液洗后滴加20%羊血清封闭30min;

　　10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h;

　　11、BufferⅢ液洗5min;

　　12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色;

　　13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。

　　试剂：

　　1.柠檬酸钠缓冲液(SSC)

　　-----------------配方(20x ssc)~~-------------

　　氯化钠3M(175 g/liter)

　　柠檬酸钠0.3 M(88 g/liter)

　　-----------------配置程序(20x ssc)---------------

　　3 M NaCl (175 g/liter)

　　0.3 M Na3citrate·2H2O (88 g/liter)

　　Adjust pH to 7.0 with 1 M HCl.

　　先加3M的氯化钠 ，再加0.3M的柠檬酸钠 ，*后用1M盐酸把pH调整到7.0

　　柠檬酸钠:弱酸

　　氯化钠:共轭碱

　　弱酸+ 共轭碱= 缓冲剂!

　　主要用于核酸杂交，不同浓度作用不同：常用2×，及0.5×

　　原理：

　　·SSC缓冲液中的盐离子(Na )中和RNA/DNA主链上的负电荷，使其呈电中性，这样可以使探针和把序列的结合比较容易进行。

　　·2×SSC：高盐洗膜，洗去部分非特异性结合的探针。

　　·0.5×SSC：低盐洗膜，增加核酸链的严紧性，使得 RNA/DNA 之间的排斥力增加。

荧光原位杂交检测

　　a)一般的荧光原位杂交检测需要指定基因特异性的探针，相对于染色体核型分析来说，可以更**和更精细地对基因进行定位分析，但失去了核型分析的宏观性。

　　b) 荧光原位杂交对基因或融合基因的扩增也能较好地检测。

　　c) 荧光原位杂交检测一般*多和分析1000个细胞的荧光信号，检测灵敏度较核型分析高。

如何选购荧光原位杂交技术FISH 用荧光显微镜

　　现在做荧光原位杂交的老师越来越多了。 购置一台适用的荧光显微镜就显的很重要，总的来说可以做如下总结：

　　1、需要选择一款正立荧光显微镜，如果钱比较充裕可以选择主机比较**一些的，以方便以后可以升级，比如OLYMPUS BX53 NIKON 80I LEICA DM 4500B 等等。如果以后不考虑升级，就可以稍微降低些主机，BX43, 55I 这类档次也都可以。

　　2、选择带通的激发快。做荧光原位杂交其实是挺怕串色的，选择带通激发块可以避免串色，UV ,B 激发需要带通，G激发选长通型的就可以了

　　3 、选择一款黑白冷CCD，尽量不要选彩色CCD. 做FISH 讲究CCD的感度要好，分辨率不要求太高。选140万像素，-15度制冷，6.45 微米像素 ，14 位灰度的CCD 是比较理想的。

　　4 、选择物镜。物镜要至少选择半复消色差物镜或者萤石物镜。这种物镜的荧光透过率好。

　　5 、荧光光源，当然要配100瓦汞灯，或者配金属卤素灯。

荧光原位杂交实验原理

　　荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

　　杂交所用的探针大致可以分类三类：

　　1)染色体特��重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测;

　　2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得;

　　3)特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

　　探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。