跨界正流行 以定量PCR来分析蛋白

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  定量PCR能分析蛋白吗?你肯定会说,开玩笑。不过这是千真万确的,一向以创新著称的美国应用生物系统公司刚刚推出了TaqMan® Protein Expression Assays,首次应用TaqMan® 分析与实时定量PCR来定量蛋白表达,能对有限数量的人胚胎干细胞培养物中的多能标志物进行快速轻松的鉴定及相对定量。

  人胚胎干细胞的鉴定是一个新兴的领域,直到现在,研究人员还需要使用颇费劳力的蛋白分析技术,如流式细胞术、免疫染色及westernblot分析。这些方法不够灵敏,本身也很难定量。TaqMan®蛋白表达分析则采用一步法裂解样品及简化的实时定量PCR流程,3.5小时就能从样品中获得数据,而所需样品量只有其他方法的1/100-1/10。

  TaqMan® 蛋白表达分析利用金标准的TaqMan® 5’核酸酶试剂来定量蛋白表达,其工作流程和样品量与普通的mRNA及microRNA分析相似。由于蛋白表达结果是来自相同的分析平台,那么这些创新的分析能够将mRNA和/或miRNA的表达与蛋白表达直接关联。其它任一种蛋白定量分析方法都不具备这个能力。

  新颖的原理

  你一定很纳闷这个试剂盒究竟是如何定量的。其实它是基于一项新颖的检测方法,称为PLA™- Proximity LigationAssay技术。PLA利用亲和纯化的抗体和实时定量PCR系统来定量检测蛋白的存在,适用于含10-500个细胞的裂解液。

  首先将细胞裂解,然后与抗体-oligo-探针(就是带了一段oligo尾巴的抗体)共同孵育。每个蛋白设计有两个探针A和B。之后用DNA连接酶将两段oligo连接起来,如图1所示。经过酶的灭活,就能够进行实时定量PCR了。

  

 

  这些预先设计的分析非常简单且可靠,没有洗涤步骤,所需的细胞量比westernblot方法低100-500倍。与传统的TaqMan®基因表达分析一样,TaqMan®蛋白表达分析所得的数据很容易进行相对定量,且极其适合多能和分化干细胞中的标志物相对定量。

  简化的流程

  TaqMan®蛋白表达分析流程运用了简单的一步法样品裂解步骤,能释放所有类型的蛋白,此步骤与TaqMan®试剂结合,创造出高度灵敏而特异的过程,来测定少量样品中的蛋白表达。整个实验过程,从样品到数据,在3.5小时内就能完成(图2),操作时间仅为1.5小时。所有试剂都已为分析细胞培养物中的蛋白而优化。样品制备过程温和,一步法细胞裂解用的是非离子型去污剂。随后样品能与任何蛋白表达分析试剂盒的分析探针混合,而分析探针的结合需要60分钟。然后加入连接酶将寡核苷酸连接起来,接着是15分钟的灭活或纯化步骤,来消化所有蛋白。再通过单次的板转移将试剂转移到PCR平板上,进行快速实时定量PCR。

  

 

  图2. TaqMan®蛋白表达分析的详细流程。每个反应孔只需要2uL起始样品(10-500个细胞/uL)。对于TaqMan®分析的步骤4,10 uL连接样品再加上混合液,构成了20uL的实时定量PCR反应终体积。

  便利易用的分析

  预先设计的TaqMan®蛋白表达分析是专为一些人蛋白靶点而开发,包括hICAM1、hCSTB、hOCT3/4、hNANOG、hSOX2和hLIN28,再加上支持试剂来监测人胚胎干细胞的相对蛋白水平。TaqMan®蛋白表达分析产品线还包括核心试剂盒、阳性与阴性对照样品细胞裂解液试剂盒,以及免费的数据分析软件。核心试剂盒中包含分析运行所需的所有试剂,包括连接体寡核苷酸、连接酶、通用的TaqMan®分析、新的TaqMan®蛋白表达快速混合液,需要与每个蛋白表达分析试剂盒一起运行分析。

  可靠的实时定量PCR平台

  TaqMan® 蛋白表达分析能够在AppliedBiosystems的任一台快速实时定量PCR系统上进行,并在一小时内得到实时定量PCR的结果。AppliedBiosystems的实时定量PCR系统提供了强大的解决方案来满足任何实验室的需求,让实时定量PCR比以往更容易开展。有了新一代软件,这些系统使用简单,当然,它们还有着AppliedBiosystems无人可比的性能、质量以及长期可靠性的记录作为支持。

  直观的数据分析软件

  所有AppliedBiosystems实时定量PCR系统所提供的精密软件包有助于实验设定、数据收集和分析性能测试。

  通过分析设计的创新改变,AppliedBiosystems将TaqMan®分析与实时定量PCR的金标准特异性、灵敏度和重复性带到了干细胞蛋白研究中。这会儿你终于相信定量PCR也能定量蛋白了吧。