转染常见问题分析及解决方案

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  基因转染是将具生物功能的核酸(RNA或DNA)转移或运送到细胞内,并使核酸在细胞内维持其生物功能的核酸转移技术。转染技术的目的是主要是研究真核基因的表达和调控,目前的方法包括磷酸钙共沉淀法,电穿孔法以及同DEAE-dextran或阳离子脂质体试剂形成复合物法。在这些不同的方法中,DNA转导的效率,转导的机制,可重复性及使用的方便性都存在差异。而且,有效的DNA转导会伴随某些毒性或细胞抑制,其程度依赖于试剂、步骤和目的细胞的不同而不同,因此建议根据实际条件和实验条件,选择*佳的转染方法。目前*常见的转染方法有如下几种:

  磷酸钙共沉淀

  将氯化钙,DNA和磷酸缓冲液混合,沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准,保证质量,因为甚至偏离*优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。

  电穿孔法

  电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异,据研究认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要,因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般,成功的电穿孔过程都伴随高水平(50%或更高)的毒性。

  DEAE-葡聚糖和polybrene

  带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。

  机械法

  转染技术也包括使用机械的方法,比如显微注射和基因枪(biolisticparticle)。显微注射使用一根细针头将DNA,RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。

  阳离子脂质体试剂

  将阳离子脂质体试剂加入水中时,其可以形成微小的(平均大小约100-400nm)单层脂质体。这些脂质体带正电,可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。使用阳离子脂质体试剂,DNA并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物。有研究报道,一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。目前对DNA转导原理的证据主要来源于内吞体和溶酶体的研究。

  阳离子脂质体介导的转染法,由于转染效率高,细胞毒性很低,操作简便等特点,逐渐成为主要的转染试剂。随着基因表达和调控研究的深入,转染技术成为研究中一种重要的实验方法,从而推动了新一代转染试剂的研发和利用。天为时代公司开发的TRANSfection和TRANSquick基因转染试剂是*新一代的阳离子聚合物转染试剂的代表,对多种细胞的转染具有*高的转染效率。