【百家讲堂第15期】HPLC各部分构成及应用

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2011-04-06 10:34 |只看楼主 1楼
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【百家讲堂第15期】HPLC各部分构成及应用

主讲人：znzyplgrace


=========================我的仪家·百家讲堂==========================

主办：

我的仪家（活动地址：http://www.18show.cn/bbs/showtopic-6909.html）


协办：

实验室社区（活动地址：http://bbs.labscn.com/showtopic-64305.html）
39检测认证论坛（活动地址：http://www.39test.com/bbs-7224.html）

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生技论坛（活动地址：http://bbs.biogo.net/read.php?tid=184274）


主讲人介绍：
  znzyplgrace主要从事药物代谢动力学，酶动力学等相关领域的分析工作，擅长使用HPLC及HPLC/MSMS等多种分析仪器。先后参与了多个课题项目的研究。熟悉HPLC,MS的结构及应用。

1.参与人员：全体注册用户

2.参与方式：
  a）请大家就“液相色谱机构及应用”的相关问题进行提问，直接回复本帖子即可

  b）提问格式：为了规范大家的提问格式，请按下面的规则来提问：znzyplgrace您好！我有以下问题想请教，请问：……

3.参加奖励：凡积极参与提问且有自己的观点或言论的都有奖（1-20财富不等）

4.活动时间：：现在就可以在此帖提问啦，截至2011年05月28日


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    本主题由 管理员 wisdom 于 2011-5-27 8:56:57 执行 主题置顶/取消 操作
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    2011-04-06 10:46 |只看楼主 2楼
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    在正式开讲之前，我先做个序吧。

    液质联用在目前的分析领域来说是越来越普遍了，在人们大肆关注质谱的时候，我个人却认为液相也是一个非常值得关注的地方。如果液相没有能很好的承担起分离功能的话，质谱只得沦为一个检测器而没有任何意义。同时，相比于金贵的质谱，最多做的也就是清洗一下进样的地方，核心部位都是不敢动的。然而液相就不一样了，还蛮经常打开捣鼓捣鼓的，因此对HPLC结构熟悉能够很好的进行故障排查，对实验非常有帮助。

    所以在这里，有请znzyplgrace为大家讲解一些HPLC的基本结构，希望能够对大家的实验有所帮助
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    2011-04-06 10:47 |只看楼主 3楼
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    HPLC的各部分构成及应用




    高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代发展起来的一种新型分析、分离技术。它是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱法的理论和技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器发展而成的现代液相色谱分析方法。现代HPLC采用了小口径柱（约1～3mm）和极细小的高效色谱填料（粒径 <5μm），用高压输液泵使溶剂以高流速（1～10cm/s）通过色谱柱，分离速度比经典柱色谱法快100～1000倍，分离效率已接近毛细管柱气相色谱法。因此， HPLC具有高压、高速、高效、高灵敏度四大特点。HPLC与GC比较，虽然需要解决延长使用寿命的问题，但专家们普遍认为在众多分析领域中HPLC比GC 更加实用。HPLC能够分析受到热稳定性和挥发性限制的化合物，而用GC分析这些化合物时则必须借助其衍生物。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用、流出组分易收集等优点，所以被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等领域[2]。


    本次图文讲座在于解析HPLC的各部分构成及应用，供大家学习参考。
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    2011-04-06 10:55 |只看楼主 4楼
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    第一部分：HPLC的各部分构成




    图一




    一.流动相
    选用的溶剂均为HPLC 等级(水 : 18 兆欧)，溶解性要好，折射率要低。 溶剂需要进行过滤和脱气以防损坏泵及柱子。过滤用专门配备的水性过滤膜和有机过滤膜分别对水相和有机相进行过滤。脱气主要是去除空气、氧气、气泡，可采用真空脱气、氦脱气或者超声波处理。
    在使用过程中会可能含有缓冲液，一般加入缓冲液目的在于调节PH/抑制离子/调节离子浓度以改善峰型、选择性、保留时间等。
    二．溶剂传输系统 (泵)--将溶剂（流动相）从溶剂瓶传送到进样器。 传输溶剂的泵需要考虑的要点：1. 流速和压力的稳定性；2. 操作方便, 可用于多种不同的溶剂；3. 防止脉冲的系统；4. 可用于等梯度模式和梯度模式；5. 久耐用。
    流路图

    图二：
    泵操作模式：等梯度模式-分析过程中，溶剂组分保持不变；梯度模式-分析过程中，按时间改变溶剂组分。
    单泵 : 低压梯度模式
    并联泵 : 高压梯度模式
    等梯度模式


    图三：


    单泵 : 氦脱气和真空脱气


    图四：


    并联泵

    图五：

    操作泵的注意点
    1. 必须对溶剂进行脱气 ；2. 勿空转；3. 使用缓冲溶液之后一定要用水清洗；4. 检查溶剂间的可混合性；5. 启动泵之前要灌泵；6. 控制脉冲；7. 检查泵压。
    三、进样系统
    进样阀：流动相中加载样品，使流动相把样品带入色谱柱。


    图六：


    进样阀包括手动进样阀和自动进样器
    使用进样阀的注意点
    1. 使用进样针前要清洗干净，并去除气泡 ；2. 清洗进样针 : 选择样品易于溶解的溶剂
    3. 附加清洗方法 :
    使用过的溶剂 → 丙酮 →二氯甲烷；4. 使用自动进样器针管清洗溶液时要格外注意；5. 连接管线越短越好 (进样阀和色谱柱, 色谱柱和检测器)；6. 管线的错误连接会导致死体积的发生。
    进样阀：1. 定量环进样阀 → 进样量由定量环体积决定；2. 需要定期清洗定量环

    图七
    进样方式
    1. 全充满：进样量是固定时-- 进样体积 : 定量环体积的三倍以上；正确性 : <0.1%。
    2. 部分充满：进样量是可改变时 --进样体积 : 小于定量环体积的一半；正确性: 1% 。
    自动进样器--自由进样，改善了实验室的生产力；极好的重现性；自动化温度控制, 预处理。
    自动进样器类型：一般包括圆盘式和栅格式。

    图八
    四、色谱柱

    图九
    色谱柱把混合物分离成各个单个成分
    色谱柱的选择根据以下四个方面进行选择：1.填料；2. 粒径；3.硅胶形状；4.孔径。
    填料性质

    图十
    粒径大小：填料的粒径越小，分离度 → 增加，背压 → 增加。


    图十一


    硅胶形状



    图十二


    不规则形
    球形

    孔径大小: nm or Å


    选择孔径大小的方法




    图十三


    一般填料特性


    孔径大小 & 分配 :
    孔径小 = 柱效高 = 减小谱带展宽现象。


    球形或不规则形 : 不规则形= 表面积大 = 碳载量高；球形 = 柱压低 = 寿命长；球形= 很好的结构稳定性 = 寿命长。


    微粒大小：微粒小 = 所能承受的操作压力高 = 柱效高。



    色谱柱分离原理：
    正相 (吸附)
    使用疏水性、非极性的溶剂→ 极性大的化合物后流出。



    图十四


    正相色谱柱
    Silica phase（硅胶柱）
    - Resolve silica, u-Porasil, Nova-Pak silica

    - Hypersil silica, Nucleosil silica, Zorbax silica

    键合固定相

    - Nova-Pak CN, NH2

    - u-Bondapak CN, NH2

    - Resolve CN, NH2

    - Hypersil CPS, APS

    - Lichrosorb CN, NH2, Diol

    - Zorbax CN, NH2
    反相分离 (分配原理)--键合固定相（C18，C8，CN，ph）与被分析物之间的分配作用，达到分离待测物的目的。 使用极性溶剂
    →
    非极性的化合物后流出。



    图十五：


    反相色谱柱
    u-Bondapak C18, CN, Phenyl
    - Resolve C8, C18, CN, Phenyl
    - Lichrosorb RP-18, RP-8
    - Delta-pak C18, C8
    - Symmetry C18, C8
    - Symmetryshield RP8
    - Hypersil ODS, Phenyl CPS
    - Zorbax ODS, C8, CN, Phenyl N, Phenyl
    正相和反相对比表



    图十六


    离子交换 --分离原理：各离子所具有的不同的电荷吸引力。



    图十七


    色谱柱填料



    图十八：


    离子交换色谱柱
    IC-pak Anion/Cation

    SAX(Strong Anion Exchanger)/SCX
    Protein-pak DEAE/SP HR
    体积排阻
    体积排阻色谱柱
    Ø
    GPC :
    Styragel HR, HT, HMW
    Series
    Ø

    Aqueous GPC :
    Ultrahydrogel Series
    Ø

    Aqueous GFC :
    Protein-pak Series
    色谱柱的选择


    图十九


    色谱柱保存方法
    色谱柱 : 用不与填料反应的溶剂填满。
    1) 正相色谱柱 : 正己烷
    2) 反相色谱柱 :
    清洗之后用60-70% 有机溶剂(CH3CN, MeOH)填满； 长期保管 : 100% MeOH, CH3CN。
    3) 离子交换色谱柱

    -     无机阴、阳离子色谱柱：长期保管: 10% CH3CN；短期保管: 流动相 or 5% CH3CN

    * IC-pak     阳离子色谱柱 : 2mM HNO3

    -     有机阳离子色谱柱：长期保管: 10% EtOH ；短期保管: 水，在 4℃

    -     有机阴离子色谱柱 : 水，在4℃
    4) 体积排阻色谱柱
    GPC色谱柱 : 指定的溶剂
    Aqueous GPC 色谱柱 : 0.05% 叠氮化钠/水或 20% 有机溶剂
    Aqueous GFC 色谱柱 : 0.05% 叠氮化钠/水20% 有机溶剂
    色谱柱的清洗

    1.     正相色谱柱(柱容量的10倍)
    甲醇-甲吡酮
    氯化物-庚烷(异辛烷)

    2.     反相色谱柱 (柱容量的10倍)
    水-甲醇-氯仿-甲醇-水

    3.     离子交换色谱柱
    阳离子色谱柱 : 水-0.1M NaOH-水-30%

    乙酸 (or 0.1N HNO3 ) –水
    阴离子色谱柱 : 水-0.1M NaOH(1~2ml)-水-

    30%     乙酸 (1~2ml)

    4.     体积排阻色谱柱 – 流动相
    五、检测器
    需要满足以下几点：
    1. 信噪比 : 高
    2. 噪音、漂移 :小
    3. 检测限 : 小
    4. 稳定的流速、温度、压力
    5. 梯度分析
    6. 选择性
    检测限/定量限


    图二十


    检测限 : S/N = 2 或 3
    定量限 : S/N = 大约 10
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    盗圣-白玉汤

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    2011-04-06 19:33 |只看该用户 5楼
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    先学习下。谢谢
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    2011-04-07 09:54 |只看楼主 6楼
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    检测器

    光学检测器

    1. 紫外/可见光检测器

    2. 荧光检测器

    3. 示差检测器

    4. 蒸发光散射检测器（ELSD）

    电化学检测器
    1. 电导检测器
    2. 电化学检测器
    检测器的特征



    图二十一


    紫外/可见光吸收检测器
    Ø光源中的特殊波长通过流动池，一部分被吸收、另一部分通过样品。

    Ø特定样品对特定波长的吸光度高。
    Ø被吸收的光能比例于样品浓度

    A=    εbc( Lambert- Beer’s Law )

    A :     吸光度

    e : 摩尔吸光系数

    b : 光程长

    C :     样品的浓度
    紫外/可见光吸收检测器
    1)固定形

    -     按光源可使用几个固定的波长

    -     波长: 214,229,254,265,280,313,340,405,436,546nm

    2) 可变形

    -     在波长190-900nm范围中选择

    图二十二


    3) 光电二极管阵列检测器

    - 同时扫描190-800nm之间的波长

    图二十三


    常用溶剂透过波长下限

    图二十四


    截至波长：当小于截至波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射会产生强烈的吸收，此时的溶剂被看作是光学不透明的。会严重干扰组分的吸收。
    因此，我们设定的检测器波长应高于溶剂的截至波长。
    利用PDA检测器的药物分析

    图二十五


    荧光检测器的光路图

    图二十六


    用FLD分析PAH

    图二十七


    示差折光检测器
    Ø原理
    -     测定根据样品浓度变化而改变的折射率之差
    -     流动池 : 样品池、参品池
    - 参品池是以流动相填满
      分析期间流动相只流过样品池

    Ø应用范围

    -     聚合物, 糖
    -     用于分析以紫外检测器和荧光检测器无法检测的样品
    Structure of RI Detector


    图二十八


    凝胶渗透检测器
    Ø决定高分子物质的分子量
    - 用标样画出校正曲线，用R.T决定未知样品的分子量
    Ø分析条件
    - 检测器 : RI 检测器



    图二十九


    GPC色谱图

    图三十


    使用 RI检测器分析糖

    图三十一


    电化学检测器

    图三十二


    ELSD 检测器
    ZAM 3000
    [img=13,13]file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image001.gif[/img]ELSD 检测器 ZAM 3000 是高灵敏的通用检测器
    [img=13,13]file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image001.gif[/img]ELSD检测用紫外检测器、示差检测器无法检测器的物质，可检测任何不挥发性物质，而且还可用于梯度洗脱。
    工作原理

    图三十三


    雾化器

    图三十四


    样品处理
    [img=13,13]file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image001.gif[/img]样品被雾化之后，一部分蒸发带到检测器，大部分被凝成小滴掉下排出。
    [img=13,13]file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image001.gif[/img]雾化器和蒸发管的材质是玻璃，因此不易被化学侵蚀，而且易于清洗。
    检测器的气体流速
    [img=13,13]file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image001.gif[/img]喷雾气体在蒸发管内被与辅助气体和混合。
    [img=13,13]file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image001.gif[/img]检测器位于蒸发管上端

    图三十五


    检测池结构

    图三十六


    电导检测器



    图三十七
    用电导检测器分析阴离子



    图三十八
    最后编辑xhxhh 最后编辑于 2011-04-07 09:57:15
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      第二部分：HPLC的应用



      注：此处列举的应用侧重食品分析，同时文字内容为xixi整理的。

      HPLC在糖类分析中的应用
      糖是由碳、氢、氧3种元素组成的有机化合物，亦称碳水化合物，根据其分子结构分为单糖、双糖、低聚糖和多糖。食品分析工作者对糖分析方法的要求是既要适用于简单食品，又要适用于复杂加工的食品，而且测定要准确、迅速、可靠。HPLC法测定糖具有明显的优势，并得到了广泛的应用。糖的HPLC测定法主要有两类。一类采用阳离子交换剂或者凝胶柱，以水、醋酸钙溶液或稀酸等作为流动相。第二类是使用化学键合固定相，流动相为乙腈－水。

      低分子糖的分析
      低分子糖的分析，是指单糖到四糖的分析，食品分析专家要求能准确地测定部分或全部果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖。果糖、葡萄糖、蔗糖的分析可以提供蔗糖转化的程度及转化糖在产品中的含量;乳糖常作为脱脂奶粉等乳制品的一个主要指标;蔗糖则是最常见的食品成分，这些都是HPLC分析食品中低分子糖的典型例子。用氨基键合相硅胶柱进行低分子糖的分析时，其典型的色谱条件是:柱长15～25cm，流动相为乙腈溶液（乙腈20～80%），检测用示差折光检测器（RID），进样量通常为10～100μL，分析时间一般在20min以内[3]。

      低聚糖的分析
      低聚糖的分析与上述低分子糖的分析极为相似，同样可用氨基健合柱，但是流动相中水的比例要增加到40～60%，分析时间较长，大约需要30min。近来国内已有不少文献报导。陈洪用HPLC法测定了饴糖中的低聚糖，发现饴糖中的低聚糖以麦芽糖为主，含量为25～39%，另外还含少量的葡萄糖、麦芽三糖和麦芽四糖，葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的最低检出限在微克级。还有文献报导了用高效液相色谱法分析蔗果低聚糖合成液和测定异麦芽低聚糖的组分[3]。

      多糖分析
      多糖的分析，主要是用于分离纯化及纯度和分子量的测定。过去常用的测定方法有超速离心法、高压电泳法、渗透压法、粘度法和光散射法等。使用这些方法，操作麻烦，结果误差很大。七十年代以后，由于耐高压合成凝胶的出现，HPLC已可用于多糖纯度和分子量的测定以及制备多糖的分离，这样效果更好。

      HPLC在氨基酸分析中的应用
      测定氨基酸的标准方法是利用与茚三酮的显色反应和离子交换色谱法分离。但是，Baky－er，E．于1976年用HPLC法分析氨基酸是利用衍生反应，使之转化成具有强荧光衍生物检测的浓度要比茚三酮反应低4－5个数量级。所以该法要比气相色谱法要灵敏。HPLC法的操作条件是采用双柱系统，柱1用梯度洗脱，柱2用恒定洗脱。荧光检测DNS－氨基酸的激发波长为340nm，发射波长为510nm。可用正相色谱分离，在1毫升/分钟流速下，柱温65℃时可得到18种氨基酸的分离图谱。也可用反相色谱分离，在1.5毫升/分钟流速下，柱温45℃可得到17种氨基酸的分离图谱。检测灵敏度和操作时间比标准方法都有很大提高。
      在该方法研究的基础上，有人先后把它用于分析粮食中的赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸。J．J．Warthesen和P．L．Lramer1987年报道用HPLC法测定强化小麦粉中游离的赖氨酸。他们先从强化的面粉或面包中提取游离赖氨酸，用三氯醋酸沉淀蛋白质，离心后取上清液用0.1M硼酸缓冲液调PH至9.0，最后定容到一定量。接着进行丹酰反应，让赖氨酸提取液与氯化丹酰丙酮液于40℃避光条件下反应生成二丹酰赖氨酸衍生物。二丹酰赖氨酸衍生物通过十八烷基键合相柱，以乙腈/0.01MNa2HPO4（2：5）为流动相，在1.5毫升/分钟流速下于8分钟后分离出来，用紫外检测器254nm外测。W．R．Peterson等人以大豆、酪蛋白、面筋、玉米为例，提出用HPLC法测定食品蛋白质中总赖氨酸和有效赖氨酸的分析方法。关于赖氨酸的测定方法与前者基本相同，只是增加一个用6.0NHCL水解的步骤，并把1.0毫克分子氯化丹酰丙酮液浓度提高到150毫克分子。在有效赖氨酸（具有游离ε－氨基的赖氨酸，若ε－氨基发生变化，会使赖氨酸失去营养强性）的测定中，又用HPLC法与氟代二硝基苯分光光度法进行了比较，其分析结果没明显差异。而且HPLC还比后者少了一个样品净化过程。色谱分离ε－二硝基苯赖氨基仍用十八烷基键同相柱，乙腈/0.01M醋酸缓冲液（20：80）（PH4.0）为流动相，于紫外可见光检测器436nm处测定[4]。
      分析强化食品中游离蛋氨酸的HPLC法是Okeefe．L．L．和Warthesen．J．J．提出的，用1.0%甲醇从强化食品中提取DL-蛋氨酸，再用三氯醋酸沉淀蛋白质，经过滤用5NNAOH把滤液PH调至9.5，用水定容后取部分提取液进行丹酰反应。蛋氨酸的丹酰衍生物与其氯化物通过十八烷基键合相柱，乙腈/0.01MNa2HPO4（1：4 ，PH7.9）作流动相，在2毫升/分钟流速下得到分离，于紫外检测器254mn处测定。
      用HPLC法测定食品中的色氨酸是利用分子本身的荧光，直接通过荧光计检测，激发波长为283nm，发射波为343nm。用多孔硅胶柱分离，PH3.8的醋酸缓冲液作流动相，在2.5毫升/分钟流速下获得大麦水解物的色氨酸分离图谱。检测范围是8×10-9―270×10-9克。在这项研究中，用含有麦芽糊精的6MNAOH水解蛋白质。麦芽糊精作抗氧剂，可提高某些酶（溶菌酶，胰凝乳朊酶）中色氨酸的回收，但对菜籽粉中色氨酸的回收没影响。同时还证明蛋白质水解时间对色氨酸回收的影响。

      HPLC在脂肪酸分析中的应用
      谷物与饲料中的脂肪酸提取物可以它们的P-溴代苯酰甲酯衍生物形式用HPLC法分离测定。在溶于氯仿/甲醇（2：1）液的类脂提取物中加入0.05N的氢氧化钾/甲醇溶液，使碱与酸的克分子比例至少在9：1，再通过旋转蒸发器浓缩样品。皂化产物不必离析出来，类脂提取物在催化剂和苯酰甲基溴化物作用下，70－80℃、30分钟之内可完成衍生反应。脂肪酸的P－溴代苯酰甲酯衍生物在十八烷基键合相柱上分离，甲醇/水（90：10）为流动相，以1毫升/分钟流速，室温条件下用紫外检测器分析。该法说明利用衍生反应分析谷物和饲料中的游离脂肪酸或从甘油三酸脂衍生而来的脂肪酸都是有效的。但在等压溶剂系统中不能把十六烷酸与油酸的衍生物分离开来，这也是与气相色谱法相比较的不同之处。不过后来有人提出用梯度洗脱可以把上两种脂肪酸分离开[4]。
      HPLC法还可以用示差折光检测器分离硬质小麦及软质小麦中含量不同的固醇软脂酸盐和固醇亚油酸盐，在多孔硅胶柱上分离，己烷/氯纺（9：1）作流动相。

      HPLC在维生素分析中的应用
      维生素C是一种对人体十分重要但人体自身又不能合成的一类重要化合物。由于它具有抗坏血酸的生理功能，又名抗坏血酸，若严重缺乏会引起坏血病。维生素C还可参与体内氧化还原反应，具有解毒的作用。30 年代时，维生素C就被广泛用于增加机体对传染病的抵抗力，近年的研究表明维生素C可预防癌症，并对肝炎、肝硬变有疗效。它可促进胶原蛋白抗体的形成，因胶原蛋白能包围癌细胞，维生素C具有抗癌作用，因它能参与神经介质、激素的生物合成，同时具有预防感冒、增强机体免疫力等功能[5]。人体自身不能合成维生素C，必须从食物摄取。维生素C广泛存在于新鲜水果和蔬菜中，测定方法一般有比色法、荧光分光光度法、化学滴定法等。由于上述方法操作烦琐，近年来多采用高效液相色谱法测定[6]。
      对于维生素的分析，除了个别几种维生素（维生素B6、B12和维生素H等）必须采用微生物法进行测定外，大多数维生素均可采用液相色谱法进行分析。水溶性维生素（B1、B2、C）的测定，将样品用酸消化后，用酶分解蛋白质，然后用溶剂提取出维生素，而脂溶性维生素（A、K、E）的测定则将食品进行皂化处理后，提取不皂化物，然后再从不皂化物中将维生素萃取出来，预处理后的两类维生素，通过液相色谱－紫外/可见检测器在各自所固有的波长条件下进行定量测定。高效液相色谱法根据不同的要求，所选择的固定相、流动相、流速、检测器和检测波长都不相同。多数方法采用荧光检测器、电化学检测器、紫外检测器或在检测中变换检测波长。李学梅测定保健食品中维生素C时，选用的色谱条件为EclipseXDB－C18 416mm×250mm 5μm柱、C18416mm×20mm 5μm预柱，流动相为甲醇：0102mol/L[2]。

      HPLC在其他物质分析中的应用
      HPLC在酸奶研究中的应用
      随着现代分析手段的不断更新，越来越多高灵敏度、高准确度的先进分析技术和方法被用于酸奶的分析检验。由于高效液相色谱（HPLC）具有快速、方便、分辨率高、分离效果好、重现性好等优点，可将其用于检测酸奶中富含的糖、脂、氨基酸、维生素等营养物质。原理是样品先经预处理后，进行液相色谱分析，HP柱用粒径为5～10μm的全多孔微粒担体作载体，将洗脱剂（流动相）以高压泵注入柱内，形成显著的压力降，样品组分迅速连续不断的在两相间进行反复多次平衡分配，以达到分离的目的，各组分流出顺序依其组分对两相间的相对亲和性。分离后的组分通过鉴定器产生讯号，经放大后在记录仪上绘出色谱峰[7]。

      HPLC法测定红葡萄酒中的白藜芦醇
      高效液相色谱法测定红葡萄酒中白藜芦醇及其甙的顺、反异构体，操作简单，精密度高，重复性好，可用于葡萄酒中白藜芦醇4种异构体的测定。众所周知，适量饮用红葡萄酒对健康极为有益白藜芦醇（resveratrol，简称RV）是红葡萄酒中发挥保护作用的主要功能因子。白藜芦醇的化学名为3，4’，5-三羟基二乙烯，在自然状态下，其3位羟基上的氢原子被一个葡萄糖分子取代形成了白藜芦醇甙（piceid，简称PD）。已有报道证实白藜芦醇具有抗炎、抗菌、抗氧化、调节脂代谢、抗凝血、调节雌激素作用及抗肿瘤等多种生物活性，因此葡萄酒（汁）中白藜芦醇含量的高低自然成为影响其保健功效的因素之一。
      　　采用高效液相色谱法（HPLC）测定白藜芦醇含量已有一些报道[。用高效液相色谱法测定水解前后顺、反式白藜芦醇含量的变化,从而计算出葡萄酒中白藜芦醇的4种异构体的含量。色谱柱为SymmetryC18柱（319 mm i.d.×150 mm），流动相为乙醇-0.05%乙酸水溶液（体积比为23∶77），紫外检测波长为306nm。其特点在于：采用阳光照射将白藜芦醇及其甙的反式异构体部分转化成顺式异构体;利用β-2葡萄糖苷酶将顺式及反式白藜芦醇甙中的β-2葡萄糖苷键水解成为相应的白藜芦醇异构体，从而解决了因葡萄酒中白藜芦醇甙峰与其他组分峰重叠而不能被直接测定的问题;通过测定酶水解前后葡萄酒（汁）中顺式、反式白藜芦醇含量的变化，计算出葡萄酒（汁）中白藜芦醇及其甙的顺、反异构体的含量[8]。

      HPLC法分析罗汉果中主要皂甙成分的研究
      罗汉果葫芦科罗汉果属多年生草质藤本植物的成熟果实，是我国传统的药用植物，临床上可用于治疗高血压、肺结核、哮喘、胃炎、百日咳、急慢性气管炎和急慢性扁桃腺炎等疾病。罗汉果的主要活性成分是葫芦素烷三萜类皂甙，关于罗汉果皂甙的分析，目前普遍应用的是香草醛－硫酸比色法和香草醛－高氯酸比色法测定总皂甙含量[9]，但分光光度法的稳定性及专属性差。H．C．Makapugay等建立的高效液相分析方法，仅能分析罗汉果甙V，不能分离分析其他皂甙组。张云竹等[10]建立一种快速高效的高压液相分析方法，对罗汉果中的主要皂甙成分进行测定。以C18柱为色谱柱，采用反相高效液相法分离分析罗汉果皂甙。结果建立了罗汉果皂甙的HPLC分析条件，其色谱条件为：流动相23%的乙腈水溶液；流速1ml/min；检测波长210nm；柱温为室温；灵敏度0.04AUFS。采用上述的液相分析方法分析四种罗汉果皂甙的含量，发现该方法简便、快速、准确、线性范围在0.5～13.75μg之间，且线性关系良好（R≥0.99），加标回收率高（94.46%～105.05%），精密度良好（RSD=1.40%～3.31%）。因此HPLC方法可用于分析罗汉果及其制品中的罗汉果皂甙含量。

      HPLC法对N－亚硝胺的测定
      N-亚硝胺可诱发肝癌、结肠癌等。某些 N-亚硝胺化合物，如 N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基四氢吡咯等也是一类致癌物质。过去采用气相色谱法测定食物中挥发性亚硝胺，其中仅色谱测定一步便需耗时1h之多，而采用高效液相色谱法则只需要13min。

      HPLC法对芳香胺的测定
      芳香胺在合成色素中应较多。当食品中色素添加过量时，对人体可造成害。因此芳香胺的分离测定在食品安全上也很重要。各种二胺异构体的分离测定可采用PermaphaseETH谱柱，移动相同甲醇－环戊烷（5∶95）。2，6-甲苯胺、2，3-二甲苯胺及苯胺的分离可用Durpakcarbowax400/Corasil，淋洗液为异丙醇－已烷（10∶90）。硝基苯胺异构体的分离用Vydac吸附剂，用已烷－氯仿（1∶1）作淋洗液。按邻、对间位顺序冲出，分离时间为3min~18min[11]。

      HPLC法对黄曲霉毒素的测定
      黄曲霉毒素是黄曲霉菌类所产生的代谢产物。各种发霉的食物如花生、大米、玉米等，都可能遭此种毒素污染。现已确定黄曲霉毒素有B1、B2、B2a、G1、G2、G2a、M1、M2等 8种结构的类似物。这些毒素毒性极强，在实验动物身上几个微克便能诱致肝癌的发生。高效液相色谱法分离测定黄曲霉毒素，可采用Sli-X-Ⅱ，室温下氯仿－异辛烷淋洗，B1、B2、G1、G2依次冲出，分析时间约7min。如PermaphaseETH，2-丙醇-水（3∶97）则以G1、B2、G2、B1次序冲出。由于黄曲霉毒素在254纳米吸收很强，因此可检测出10－9。此外，此毒素还能产生荧光，应用荧光检测器则检出灵敏度可更高。
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      2011-04-07 10:02 |只看楼主 8楼
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      结语

      高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。与试样预处理技术相配合，HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。由于高压输液泵的使用，相对于经典液相色谱，其分析时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟。因此，高效液相色谱技术在食品分析领域具有巨大的现实意义。
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      2011-04-07 10:02 |只看楼主 9楼
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      参考文献：
      [1] 黄佩芳．现代色谱分析法测定食品中的碳水化合物[J]．中国食品添加剂，2002，3：81-100
      [2] 刘世战，吴丽．高效液相色谱法在食品维生素测定中的应用[J]．漯河职业技术学院学报，2006，5(4)：6-7
      [3] 甘宾宾，蒋世琼．食品中糖类的高效液相色谱法测定[J]．分析仪器，2000(3)：38-44
      [4] 张式俭．高压液相色谱方法在粮油食品分析中的应用[J]．粮食储藏，1984(2)：40-42
      [5] 刘长建．青椒中维生物C的高效液相色谱分析[J]．大连轻工业学院学报，2004，23(3)：229-230
      [6] 姜波，范圣第，刘长建．菠萝中维生素C的高效液相色谱分析[J]．大连民族学院学报，2003，5 (1)：52-53
      [7] 段善海，缪铭．现代分析技术在酸奶研究中的应用[J]．食品科学，2006：854-857
      [8] 孙狄，章震兴，王轶男，时卫萍．高效液相色谱法测定红葡萄酒中白藜芦醇的四种异构体[J]．2004，22(4)：424-427
      [9] 杜态德．皂甙及其甙元分析方法研究进展[J]．西北药学杂志，1991，6(1)：42-44
      [10] 张云竹，戚向阳，陈维军，张俐勤．罗汉果中主要皂甙成分的高效液相分析研究[J]．食品科学，2006：224-227
      [11] 胡滨，陈一资，胡惠民．高效液相色谱法在食品快速检测中的应用[J]．农产品加工，2007，2：33-35
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      内容信息量很大，可以做课件了。呵呵
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