【百家讲堂第14期】高效液相色谱在药物分析中的应用

    高效液相色谱(HPLC)是2O世纪7O年代迅速发展起来的一种分离分析技术，是目前各种色谱模式中应用最广的一个领域。据估计，世界上几百万种化合物中除20％宜用气相色谱(Gc)分离分析外，其余80％的化合物，包括大(高)分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC(正相HPLC、反相HPLC、离子交换色谱和离子色谱、体积排除色谱、亲合色谱等)进行分离分析。因此，自8O年代以来HPLC成为国际分析化学界发展最快的一个分支，无论是仪器的销售额，还是论文的发表数，均雄居同期所有分析仪器的首位，在很多学科领域内都得到了广泛的应用。

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    HPLC仪器一般由输液系统、进样器、柱、检测器和计算机控制系统(工作站)组成（如图1），制备型仪器还配有馏份收集系统。人们要求HPLC仪器具有更高的准确度，更好的精确度，更高的灵敏度及更好的重现性。检测器用于连续检测色谱柱流出的物质，进行定性定量分析。要求其灵敏度高、噪音小、基线稳定、响应值的线性范围宽等。近年来各国都在研究开发新的检测技术，进一步扩大了HPLC的应用。

    近来较重要的发展是检测部分的发展。二极管阵列检测器已普遍应用，可快速提供检测物的紫外光谱，以帮助鉴别。蒸发光散射检测器对无紫外吸收的化合物，如甾体化合物等，具有较好的检出灵敏度。液相色谱-质谱联用技术，接口部分巳取得重要进展。由粒子束、热喷雾，发展到最近的电喷雾接口，联用技术日趋成熟，性能大大改进。液相色谱-质谱联用能给出分析物的质谱图，提供分析物的结构信息，对鉴别非常有利。液相色谱一双质变联用增加了分离能力，并提供更多的结构信息，检测灵敏度也大大提高。

2.1天然药物分析
    天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行分离鉴定，再测定有效成分的含量；通过指纹图谱（图2）建立识别模式，可以判定药材的质量高低。

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2.2 天然药物及复方成药分析
    复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。增免扶正片系由当归、党参、黄芪（图3）等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心、肝、脾、肾虚、纳差、心脑血管疾病、神经衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。
    由于化学药品的开发费用昂贵，而且毒副作用大，近年来人们已把目光转向自然、民族传统医药、草药、植物药等天然药物，据世界卫生组织统计，当前全世界60多亿人口中80％的人使用过天然医药。在全世界药品市场中，天然物质制成的药品已占30％，国际上植物药市场份额已达300亿美元，且每年以20％ 以上的速度增长。HPLC分析必定能为我国传统中医药实现现代化，走向世界提供强有力的技术支持。

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2.3 抗生素分析
    抗生素是由微生物或其他方法产生的化学物质，在高度稀释的情况下仍具有抑制或杀灭其他微生物的性能。抗生素的分离、分析和定量测定是药物分析中较困难的领域。采用较多的方法是微生物法、分光光度法和化学方法，但所需时间较长、专一性较差。
HPLC分析技术近年来在抗生素的质量控制中已广泛应用。对结构、组分等较清楚的药物，HPLC分析将逐步取代传统的生物测定。目前，各国药典中应用HPLC技术对抗生素进行质量控制的项目包括鉴别、组分分析、含量测定和相关物质测定等。

2.4 手性药物分析
    在生物体内，几乎所有具有重要生理意义的有机生物分子都有手性(chirality)，绝大多数都是旋光性物质。两种化学组成、分子式完全相同的化合物，但因组成化合物的原子在空间取向不同，而成为镜像的化合物，称为手性化合物。由于对映体的物理、化学性质相同，实现它们的分离就比较困难，如大多数氨基酸都有右旋体和左旋体，但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物。手性药物往往呈现一种对映体具有强的生物活性和药效，而另一种却无效。近年来，对手性药物的拆分定量分析进行了广泛深入的研究。其中，对生物体液中药物对映体的分离分析，有利于了解各种对映体的药代动力学、体内代谢过程和生物利用度。因此对手性药物对映体的拆分也是HPLC分析的热点。手性HPLC拆分法是以现代HPLC技术为基础引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异而进行分离。HPLC法拆分手性药物对映体可分为直接法和间接法。前者是将不对称中心引入分子间，可分为手性流动相添加剂(CMP)法和手性固定相(CSP)法；后者又称为手性试剂衍生化(CDR)法，它是将不对称中心引入分子内。
    手性试剂衍生化法是将对映体经手性试剂衍生，生成非对映异构体后，利用常规HPLC方法进行分离和测定。适用于不宜直接拆分测定的化合物如手性脂肪胺类、醇类等。该法分离效果好，分离条件简便，但对手性衍生试剂的要求较高，操作比较麻烦，多在其它方法无法实现时才采用。对生物样品中对映体拆分过程中，由于内源性物质及代谢产物的干扰，单用HPLC分析，易造成谱峰重叠，不能直接分析体内手性药物。目前，使用多柱偶联技术已成功解决了该类问题。
    目前，HPLC是在手性药物拆分中应用最多的方法之一，可以预见，该方法因其具有快速、方便、精确的特点，在未来的手性药物研究中，将得到更广泛的应用（图4）。

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2.5 在鉴别中的应用
    在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别.

2.6 在杂质检查中的应用
    HPLC分离效能高,灵敏,在药物的杂质检查中应用广泛.主要用于药物中有关物质的检查.“有关物质”是指药物中存在的合成原料,中间体,副产物,降解产物等物质,这些物质的结构和性质与药物相似,含量很低,只有采用色谱的方法才能将其分离并检测.若杂质是已知的,又有杂质的对照品,可用杂质对照品做对照进行检查.若杂质是未知的,可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查.

2.7在含量测定中的应用
    用高效液相色谱法侧定含量可以消除药物中的杂质,制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰.中药材及其制剂组成复杂,基中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法.

2.8 在体内药物分析中的应用
    HPLC由于测定迅速准确，流动相选择范围广，灵敏度高(10-12 g／mL以上)，填充柱种类多，且可供选择的检测器也多。所以是实验室研究中一种很好的体内分析方法。在国内外都很受重视．大多数药物都有紫外吸收，所以最常用的检测器是紫外检测器。多数药物及内源性物质极性均较大，利用其极性差，可以采用RP-HPLC色谱柱，可获得良好分离效果。